Il striscio batterico è un'estensione di film sottile di una sospensione di microrganismi batterici che viene realizzata su una lastra di vetro trasparente o un vetrino, per l'osservazione al microscopio ottico.
L'estensione in forma di film viene effettuata in modo da separare il più possibile i microrganismi, poiché se raggruppati l'osservazione non è chiara.
Nello studio delle colture batteriche, vengono utilizzate tecniche di preparazione, fissazione e colorazione degli strisci per analizzarle meglio. A causa delle piccole dimensioni dei microrganismi, per la loro osservazione è necessariamente richiesto l'uso di un microscopio ottico..
I microscopi ottici sono strumenti indispensabili per l'osservazione degli strisci. Questi impiegano lenti ottiche e luce che consentono la visualizzazione dei campioni con un grande ingrandimento..
In generale, le cellule viventi non hanno strutture per lo più colorate, viste al microscopio ottico sono campioni incolori, trasparenti e mostrano un contrasto interno e con il loro ambiente molto scarso..
L'osservazione con il semplice microscopio ottico a campo chiaro, senza l'utilizzo di tecniche di colorazione ausiliarie, è molto limitata e viene utilizzata solo in alcuni casi, come nell'osservazione del movimento dei microrganismi.
Per un'osservazione ottimale dei microrganismi, è necessario trovare un equilibrio tra contrasto e risoluzione. I dettagli delle cellule non possono essere visti al microscopio, anche ad alta risoluzione; l'uso di coloranti è richiesto attraverso tecniche di colorazione, che forniscono contrasto per l'osservazione.
Indice articolo
Per ottenere un contrasto eccellente ci sono sofisticati microscopi chiamati microscopio a contrasto di fase, microscopio a interferenza differenziale e microscopio a campo scuro. Questo tipo di microscopio viene utilizzato per osservare strutture batteriche come guaine e filamenti, tra gli altri..
La colorazione è una tecnica semplice per aumentare il contrasto che si ottiene con un microscopio a campo chiaro. In questa tecnica, possono essere utilizzati diversi coloranti che migliorano significativamente l'osservazione microscopica..
Le colorazioni vengono eseguite direttamente sugli strisci o sulle estensioni delle sospensioni di microrganismi sui vetrini, precedentemente essiccati e fissati..
La fissazione è una tecnica utilizzata per preservare le strutture cellulari; provoca l'inattivazione dei microrganismi e l'adesione al vetro del vetrino. Esistono diversi trattamenti di fissazione: fissazione termica e fissazione chimica.
Questo è il metodo più utilizzato per osservare gli strisci batterici. La tecnica consiste nel far passare la sospensione batterica dello striscio attraverso la fiamma di un accendino. Questa tecnica è in grado di preservare la morfologia esterna dei batteri, ma distrugge le loro strutture interne..
La fissazione chimica utilizza sostanze chimiche di conservazione, come formaldeide o formaldeide, etanolo e acido acetico, tra gli altri. Il vantaggio dell'utilizzo di agenti di fissaggio chimici è che si ottiene la conservazione delle strutture cellulari interne dei microrganismi..
Le procedure più comuni per la colorazione di uno striscio precedentemente essiccato e fissato sono la colorazione positiva o semplice, la colorazione differenziale e la colorazione negativa. Esistono anche tecniche speciali per la colorazione di particolari strutture cellulari (capsule, spore, flagelli).
La colorazione positiva o semplice è la tecnica di colorazione a striscio più utilizzata. Utilizza coloranti che hanno la capacità di legarsi a determinate strutture microbiche, permettendo loro di essere osservate al microscopio.
Questi coloranti hanno gruppi cromofori (porzione colorata) nella loro struttura chimica, con doppi legami alternati e legami singoli (coniugazione). Questi legami possono a loro volta stabilire legami ionici o covalenti con alcune strutture cellulari..
Le macchie utilizzate nella colorazione positiva o semplice sono per lo più derivati chimici del anilina (sali organici colorati).
D'altra parte, tra i coloranti possiamo trovarne alcuni con un pH basico e altri con un pH acido..
Nei coloranti di base, il gruppo cromoforo ha una carica elettrica positiva. La stragrande maggioranza dei microrganismi procarioti ha un pH interno neutro e la loro superficie cellulare è caricata negativamente. Attraverso questa interazione elettrostatica, il cromoforo si lega alla cellula e la colora.
Esempi di coloranti di base sono blu di metilene, violetto di cristallo, verde malachite, fuscina di base, safranina, tra gli altri..
Nei coloranti acidi, il gruppo cromoforo ha una carica elettrica negativa. Questi sono usati per colorare le proteine con gruppi amminici caricati positivamente. Esempi di coloranti acidi sono la fuscina acida, la rosa bengala, il rosso Congo e l'eosina.
La tecnica di colorazione differenziale consiste nell'applicare due coloranti di diverso colore o intensità, per distinguere diversi microrganismi al microscopio. La colorazione di Gram e la colorazione acido-alcol resistente sono le colorazioni differenziali più utilizzate in batteriologia.
La colorazione di Gram viene utilizzata come test preliminare per conoscere la forma, le dimensioni, il raggruppamento cellulare e il tipo di parete cellulare. Utilizzando il test della colorazione di Gram, i batteri della parete cellulare vengono classificati in batteri Gram positivi e batteri Gram negativi..
In questa tecnica vengono utilizzati coloranti chimici che non penetrano all'interno della cellula, ma fanno apparire il mezzo in cui si trovano i microrganismi come uno sfondo nero..
Nella tecnica di colorazione negativa, lo striscio viene realizzato con una goccia di inchiostro di china o sospensione di nigrosina, che dopo aver lasciato asciugare a temperatura ambiente forma una pellicola opaca al passaggio della luce. In questo modo, i microrganismi sono visti come forme luminose su uno sfondo scuro..
1.- Lavare molto bene i vetrini, asciugarli con carta assorbente ed etichettarli. L'etichetta deve indicare il contenuto del preparato, la data e il nome della persona che lo ha elaborato..
2.- Accendere l'accendino e sterilizzare il ciclo di inoculazione sulla fiamma fino a quando non diventa rosso vivo.
3.- Lascia raffreddare il manico.
4.- Prendere la provetta di coltura batterica, togliere il tappo e passare velocemente l'imboccatura della provetta vicino alla fiamma del bruciatore (fiamma).
5.- Inserire l'ansa da inoculo nella provetta contenente la coltura batterica e prelevare il campione.
6.- Se la coltura è in mezzo liquido, posizionare il campione prelevato con il manico al centro del vetrino e distribuirlo con cura in un cerchio di circa 2 cm di diametro..
7.- Sterilizzare nuovamente l'anello di inoculazione.
8.- Lasciare asciugare lo striscio all'aria.
9.- Ripetere i passaggi da 3 a 8 tre volte.
10.- Se la coltura è in mezzo solido, una goccia di acqua distillata deve essere preventivamente posta sul vetrino. Questo viene fatto per miscelare un piccolo campione della coltura prelevata con il loop di inoculo, come indicato nei passaggi da 2 a 5 (condizioni asettiche).
11.- Distribuire il campione diluito con la goccia d'acqua sul vetrino e ripetere tre volte.
1.- Aggiungere due gocce di metanolo o etanolo assoluto agli strisci secchi delle colture in mezzo liquido..
2.- Lasciar asciugare all'aria lontano dall'accendino.
3.- Se lo striscio proviene da una coltura su terreno solido, lo striscio secco viene fissato con il calore, facendolo passare 2 o 3 volte velocemente attraverso la parte più calda della fiamma dell'accendino..
4.- Toccare la parte inferiore dello striscio con la parte dorsale della mano sinistra (per i destrimani; altrimenti usare la mano destra) e verificare che sia fredda.
1.- Aggiungere allo striscio 2 gocce del colorante selezionato e lasciare agire per il tempo richiesto nei protocolli specifici per ogni macchia (generalmente tra 1 e 5 minuti).
2.- Alcune macchie richiedono l'uso del calore per la loro attivazione, nel qual caso bisogna stare molto attenti nel riscaldare il vetrino alla fiamma dell'accendino (manipolarlo con una pinzetta ed evitare l'ebollizione). Un surriscaldamento dello striscio può distruggere le cellule da osservare..
3.- Rimuovere il colorante in eccesso lavando con acqua distillata da una picette. Rimuovere l'acqua di lavaggio picchiettando delicatamente il vetrino sul bordo, inclinato sul piano di lavoro.
4.- Lasciare asciugare all'aria.
5.- A seconda del tipo di osservazione, in questa fase viene utilizzato o meno un vetrino coprioggetto. Il coprioggetto protegge e preserva lo striscio. Se in questa fase viene eseguita un'osservazione di immersione in olio, non vengono utilizzati coprioggetti ma lo striscio non può essere conservato.
1.- Immergere lo striscio successivamente in ciascuna delle soluzioni indicate di seguito, per un minimo di 5 minuti. Lo scopo di questi "bagni" è quello di lasciare lo striscio completamente disidratato. Ogni reagente deve essere ben drenato prima di introdurre lo striscio nel bagno successivo..
L'ordine dei bagni disidratanti è il seguente:
Quindi lasciare asciugare all'aria.
2.- Montare il vetrino coprioggetto, preferibilmente 22 × 22 mm, utilizzando balsamo canadese o altro mezzo di montaggio.
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