Il conteggio standard di agar È un terreno di coltura solido e non selettivo progettato per la quantificazione del carico microbico aerobico presente in campioni di acqua potabile, acque reflue, bevande a base di latte, tra gli altri alimenti. Questo terreno è anche noto come PCA agar, per il suo acronimo in English Plate Count Agar. È stato creato nel 1953 da Buchbinder, Baris e Goldstein.
Il terreno agar conteggio standard è composto da estratto di lievito, triptein, glucosio, agar e acqua distillata. Questa formulazione contiene elementi nutritivi di base che consentono lo sviluppo dell'attuale carica microbica aerobica, non impegnativa.
Poiché il terreno non contiene inibitori, i batteri possono crescere senza restrizioni, rendendolo ideale per il conteggio generale delle colonie. Tuttavia, la tecnica di quantificazione su piastra non rileverà tutti i batteri presenti, ma solo quelli che sono in grado di crescere nelle condizioni ambientali a cui è sottoposto l'agar conteggio standard seminato..
In questo senso, la tecnica di quantificazione su piastra cerca generalmente di determinare la quantità di batteri di tipo mesofilo aerobico, cioè quelli che si sviluppano a temperature comprese tra 25 e 40 ° C, con una temperatura di crescita ottimale di 37 ° C..
Questo gruppo batterico è molto importante, perché la maggior parte dei batteri patogeni per l'uomo si trova lì..
Va notato che a volte può essere interessante quantificare la quantità di batteri psicrofili presenti nel cibo. Questi batteri sono quelli che si sviluppano a basse temperature (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.
Allo stesso modo, i batteri termofili, che si sviluppano in un intervallo compreso tra 50 ° C e 80 ° C o più, possono essere importanti in alcuni tipi di alimenti come i cibi in scatola..
La quantificazione microbica è espressa in unità formanti colonie (CFU) per grammo o millilitro di campione.
Indice articolo
Il terreno di conteggio standard è progettato per consentire la crescita di batteri aerobi non esigenti, poiché l'estratto di lievito, la triptein e il glucosio forniscono i nutrienti necessari per una buona crescita microbica..
D'altra parte, il terreno ha un colore chiaro e un aspetto trasparente, motivo per cui è ideale per la visualizzazione delle colonie sviluppate dal metodo di semina profonda (plate pouring)..
È anche possibile il conteggio delle colonie con il metodo di semina superficiale della spatola Drigalski..
Quando la carica microbica è elevata, devono essere effettuate diluizioni decimali del campione in esame per poter contare le CFU.
Va notato che questo terreno è raccomandato dall'American Public Health Association (APHA) per il conteggio dei mesofili aerobici..
Pesare 23,5 g del terreno disidratato e sciogliere in un litro di acqua distillata. Per dissolversi completamente, la miscela deve essere riscaldata mescolando frequentemente fino a quando non bolle. I passaggi successivi dipendono dalla tecnica di semina da utilizzare.
Distribuire erogando da 12 a 15 ml nelle provette. Successivamente sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti. Lasciar solidificare verticalmente a forma di blocco. Conservare in frigorifero fino al momento dell'uso.
Sciogli la spina quando la utilizzerai. Una volta sciolto, tenerlo a bagnomaria a 44-47 ° C durante la preparazione dei campioni..
Sterilizzare il terreno in un'autoclave a 121 ° C e quindi distribuire 20 ml in piastre Petri sterili. Lasciar solidificare, capovolgere e conservare in frigorifero fino al momento dell'uso.
Temperare le piastre prima dell'uso. Il pH del mezzo deve essere 7,0 ± 0,2.
Standard Count Agar viene utilizzato nella tecnica di conteggio dei mesofili aerobici durante l'analisi microbiologica di acqua e cibo. Il conteggio dei mesofili aerobici è necessario, poiché determina la qualità sanitaria del campione in esame..
L'applicazione di questa tecnica (utilizzando questo terreno) consente la visualizzazione macroscopica di colonie isolate per la loro quantificazione..
La tecnica consiste di quanto segue:
1) Omogeneizzare il campione per ridistribuire i batteri presenti.
2) Si prepara una sospensione iniziale in una bottiglia o sacca sterile, rispettando il rapporto di 10 gr o 10 ml di campione in 90 ml di diluente (10-1).
3) Dalla sospensione iniziale si effettuano le opportune diluizioni decimali a seconda del tipo di campione. Es: (10-Due, 10-3, 10-4). Le diluizioni vengono effettuate con acqua peptone o tampone fosfato..
Per fare questo, prelevare 1 ml della sospensione iniziale e metterlo in 9 ml di diluente, continuare le diluizioni se necessario, prelevando ora 1 ml della diluizione 10-Due e così via.
4) Prendere 1 ml di ciascuna diluizione e collocare in piastre Petri sterili vuote.
5) Aggiungere a ciascuna piastra da 12 a 15 ml di agar standard di conteggio precedentemente sciolto e depositato a 44 - 47 ° C.
6) Ruotare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente il campione lungo l'agar e lasciarlo solidificare..
7) Capovolgere le piastre e incubare a 37 ° C in aerobiosi per 24-48 ore.
8) Al termine del tempo si esaminano le piastre e si contano le colonie nella diluizione che lo consente. Vengono scelte per il conteggio quelle piastre che hanno da 30 a 300 CFU.
Il conteggio può essere eseguito manualmente oppure è possibile utilizzare l'attrezzatura del contatore di colonie.
I valori consentiti per ml di campione possono variare da un paese all'altro a seconda delle normative che li disciplinano..
Il calcolo generale viene eseguito utilizzando la seguente formula:
Esprimi i risultati in 1 o 2 cifre, moltiplicando per la base appropriata 10. Esempio: se il risultato è 16.545, viene arrotondato in base alla terza cifra a 17.000 e sarà espresso come segue: 1,7 x 104. Ora, se il risultato fosse 16.436, arrotondalo a 16.000 ed esprimi 1,6 x 104.
-Inoculare con 0,1 ml del campione diretto se è liquido, sospensione iniziale 10-1 o 10 diluizioni consecutive-Due, 10-3 ecc., al centro di una piastra di agar conteggio standard.
-Distribuire uniformemente il campione con una spatola Drigalski o una bacchetta di vetro a forma di L. Lasciar riposare per 10 minuti.
-Capovolgere le piastre e incubare in aerobiosi a 37 ° C per 24-48 ore.
-Procedere al conteggio delle colonie, scegliere quelle piastre che si trovano in un range compreso tra 20 e 250 CFU.
Per il calcolo viene applicato il fattore di diluizione, che è l'inverso. Il numero viene arrotondato a 2 cifre significative (arrotondamento in base alla terza cifra) ed espresso in potenza di base 10. Ad esempio, se nel campione si contano 224 CFU senza diluizione (10-1), È riportato 22 x 101 UFC, ma se il dato fosse 225 viene riportato 23 x 101 UFC.
Ora se conti 199 CFU nella diluizione 10-3, sarà riportato 20 x 104 CFU, ma se vengono contati 153 CFU nella stessa diluizione, verrà riportato 15 x 104 UFC.
Il terreno di coltura con conteggio standard può essere valutato utilizzando ceppi noti certificati, come: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus E se ne andò 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.
Se il terreno di coltura è in condizioni ottimali, si prevede una crescita soddisfacente in tutti i casi, ad eccezione di L. fermentum che può avere una prestazione regolare.
Per valutare la sterilità del terreno di coltura, incubare una o due piastre di ciascun lotto preparato (senza inoculo) a 37 ° C in aerobiosi per 24 ore. Trascorso questo tempo, non si dovrebbe osservare alcuna crescita o cambiamento di colore del terreno..
-Non sciogliere l'agar più di una volta.
-Il terreno preparato può durare fino a 3 mesi purché conservato in frigorifero e protetto dalla luce..
-Questo terreno non è adatto per microrganismi esigenti o anaerobici.
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