Il colorazione con ematossilina-eosina è una tecnica di colorazione che utilizza la combinazione di coloranti ematossilina ed eosina. Questa coppia di coloranti costituisce una coppia perfetta, poiché l'ematossilina agisce come un colorante di base e l'eosina è un colorante acido..
La designazione di coloranti basici o acidi non si riferisce al pH che ottengono in soluzione, ma piuttosto parla della proporzione prevalente in termini di cariche anioniche o cationiche che possiedono o dalla posizione del gruppo cromoforo..
In questo senso, l'ematossilina è considerata un colorante basico (cationico) e quindi ha un'affinità per le strutture acide, come il nucleo delle cellule. Mentre l'eosina, essendo un colorante acido (anionico), ha un'affinità per le strutture alcaline o basiche, come il citoplasma cellulare.
Per questo motivo, questa combinazione di coloranti è ampiamente utilizzata per la colorazione dei tessuti, poiché consente di distinguere chiaramente nuclei e citoplasmi. I nuclei si colorano di blu scuro o viola e rosa del citoplasma.
La colorazione con ematossilina-eosina è una delle tecniche di colorazione più utilizzate nell'area dell'istologia e della citologia, grazie alla sua facile manipolazione e al basso costo. Viene utilizzato per la visualizzazione di cellule, fibre nervose spesse e la presenza di alcuni microrganismi nei tessuti, come: parassiti, funghi e batteri, tra gli altri.
Indice articolo
L'ematossilina è un colorante neutro. Tuttavia, il componente che fornisce il colore (cromoforo) si trova nel centro cationico o basico della molecola. Da qui la sua affinità per le strutture acide. La sua formula chimica è C16H14O6 e il suo nome scientifico 7,11b-diidroindeno [2,1-c] cromene-3, 4,6a, 9,10 (6H) -pentolo.
Colora principalmente i nuclei delle cellule, poiché sono molto ricchi di acidi nucleici. Può anche macchiare inclusioni citoplasmatiche di origine virale.
Affinché l'ematossilina si macchia, deve essere in uno stato ossidato e legata a un metallo. Quest'ultimo servirà a fissarsi al tessuto, cioè agirà come un mordente.
Quando l'ematossilina è ossidata si chiama emateina. L'ossidazione si ottiene con l'esposizione all'ossigeno (invecchiamento) del reagente o con sostanze che ne aiutano l'ossidazione (ossidazione chimica).
L'eosina è un colorante che si colora di rosso o rosa. È insolubile in acqua sebbene esista una versione solubile in acqua. Generalmente, l'eosina viene preparata sciogliendo in alcool (etanolo a 95 °).
Colora citoplasmi, fibre muscolari, organelli citoplasmatici e collagene, ma non macchia i nuclei cellulari. Questo perché è caricato negativamente, quindi ha un'affinità per le strutture caricate positivamente..
Esistono due tipi di eosina "Y" e "B". L'eosina "Y" è nota come eosina gialla. Il suo nome scientifico è tetrabromo fl uoresceina e la sua formula chimica è CventiH8Br4O5.
D'altra parte, l'eosina "B" è talvolta indicata come eritrosina B. bluastra. Il suo nome scientifico è dibromodinitro fluoresceina e la formula è CventiH8BrDueNDueO9. Entrambi sono molto simili e la differenza tra l'utilizzo dell'uno o dell'altro non è davvero evidente. Tuttavia, il più popolare è l'eosina "Y".
L'eosina ha la proprietà di distinguere tra una cellula vivente e una morta, poiché è in grado di attraversare la membrana per colorare il suo citoplasma solo quando le cellule sono morte, lasciando il citoplasma della cellula incolore se rimane in vita.
Con l'ematossilina-eosina, le fibre nervose spesse possono essere colorate e identificate. Tuttavia, non è utile per colorare le fibre nervose sottili, poiché è necessaria una colorazione d'argento per visualizzare queste ultime..
Nella colorazione dello strato corneo della pelle, il colorante che agisce è l'eosina, poiché a questo livello le cellule non hanno un nucleo.
Nello strato granulare della pelle, l'ematossilina colora fortemente i granuli di cheratoialina all'interno delle cellule dei granuli. Al contrario, lo strato spinoso della pelle è debolmente macchiato di ematossilina, mentre lo strato basale o germinale è sufficientemente colorato.
L'eosina colora il citoplasma di tutte le cellule e l'intensità del colore può variare da uno strato all'altro..
Gómez et al., Nel 2005 hanno dimostrato che la colorazione con ematossilina-eosina era più efficace nell'identificare i casi di amebiasi dovuta a Entamoeba histolytica Y Entamoeba dispar rispetto al metodo di visualizzazione fresca (soluzione salina e lugol) nei pazienti con malattia diarroica acuta.
È stato anche dimostrato che è altamente sensibile nel rilevare l'eritrofagocitosi (amebe che hanno inghiottito gli eritrociti).
Walwyn et al., Nel 2004 hanno proposto l'uso di coloranti istologici per rilevare i microrganismi che causano infezioni.
Utilizzando la colorazione con ematossilina-eosina, sono stati in grado di visualizzare le infezioni causate da Clostridium, Actinomyces, spirillae o Candida. Sono anche riusciti a osservare la presenza del parassita Sarcoptes escabiei in sezioni di pelle e inclusioni virali da citomegalovirus ed herpes in sezioni di vari tessuti.
La colorazione della sezione istologica passa attraverso una serie di passaggi. La prima cosa è ottenere la sezione istologica. Questa deve essere cerata per ottenere successivamente i tagli (ultrafini) con un microtomo. La tecnica consiste nei seguenti passaggi:
1-Eliminazione della paraffina in eccesso: per questo puoi usare xilolo o Heme-D, immergere per 3-5 minuti.
2-Reidratazione del campione: Ciò si ottiene immergendo il campione in diverse concentrazioni di alcoli (etanolo) in ordine decrescente (100 °, 90 °, 70 °). In tutti i casi per 7 minuti.
3-Eliminazione dell'eccesso di alcol: per fare questo si immerge in acqua per 7 minuti.
4-Colorazione con ematossilina: il campione viene immerso per 6-10 minuti in un vassoio contenente ematossilina. Il tempo di esposizione dipende dalle dimensioni e dallo spessore del campione..
5-Eliminazione dell'eccesso di ematossilina: Si lava con acqua per 5 minuti e poi si effettua un rapido passaggio (10-20 secondi) attraverso alcool acido. Successivamente viene nuovamente lavato con acqua per 5 minuti. Quindi viene immerso in etanolo a 96 ° per 1 minuto.
6-Colorazione con eosina: per questo, il campione viene immerso per 5 minuti nel vassoio dell'eosina.
7-Disidratazione del campione: per questo, i vassoi dell'alcool (etanolo) vengono ripassati, ma questa volta in ordine crescente. (70 °, 90 °, 100 °). (Rispettivamente per 5 secondi, 5 secondi, 1 minuto).
8-Chiarificazione del campione: per questo, viene esposto a xilolo per 5-10 minuti e asciugato per sigillare in modo permanente con balsamo del Canada o altro materiale simile.
Viene eseguito uno striscio con le feci del paziente su un vetrino e fissato con alcol all'80% per 5 minuti. Il foglio viene immerso in ematossilina per 5 minuti e immediatamente lavato con acqua..
Successivamente, viene rapidamente immerso in alcool acido e quindi in acqua di ammoniaca. Viene lavato con acqua. Viene colorato per 5 minuti in eosina. Il campione viene disidratato come spiegato nell'arte nota e infine viene risciacquato con xilene.
In un litro di acqua distillata sciogliere 50 grammi di solfato di alluminio di potassio o ammonio. Quando completamente sciolto, aggiungere 1 grammo di ematossilina cristallizzata. Quando si dissolve completamente, 1 g di acido citrico viene aggiunto insieme a 50 g di idrato di cloralio e 0,2 g di iodato di sodio..
La miscela viene fatta bollire per 5 minuti, quindi lasciata raffreddare e filtrata per rimuovere eventuali particelle solide rimaste. Il reagente così preparato può essere utilizzato immediatamente.
Può essere preparato a base alcolica oppure a base acqua.
In 100 ml di etanolo a 95 ° sciogliere 0,5 grammi di eosina "Y". Quindi aggiungere qualche goccia di acido acetico glaciale.
In 1250 ml di acqua distillata sciogliere 25 grammi di eosina idrosolubile "Y". Quindi aggiungere qualche goccia di acido acetico glaciale.
Misurare 0,5 ml di acido cloridrico concentrato e portare a 100 ml con alcool assoluto.
Misurare 0,5 mL di ammoniaca concentrata e portare a 100 mL con acqua distillata.
Nessun utente ha ancora commentato questo articolo.