Il Test di Voges-Proskauer è un test biochimico utilizzato per identificare i batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae. È particolarmente utile per differenziare i ceppi di Escherichia coli a partire dal Klebsiella e Enterobacter, tra l'altro.
Il test viene eseguito in un terreno di coltura liquido denominato Methyl Red-Voges Proskauer, meglio conosciuto con l'acronimo RM / VP. Questo terreno è composto da polipeptone tamponato, glucosio, fosfato dipotassico e acqua distillata..
L'attuale terreno RM / VP è una modifica del terreno Clark e Lubs, che originariamente conteneva una concentrazione inferiore di peptoni e glucosio. Pertanto, è stato prodotto meno ione idrogeno, necessario per la reazione positiva di Voges-Proskauer..
Il test si basa sulla capacità del microrganismo di utilizzare il glucosio per via butilenglicole e formare un prodotto finale neutro chiamato acetoina, in presenza di ossigeno e un pH alcalino.
Nel mezzo RM / VP, oltre a poter rivelare il test di Voges-Proskauer, può essere rivelato anche il test del rosso metile.
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I pluripeptoni presenti nel terreno forniscono i requisiti nutrizionali essenziali per la crescita batterica. Da parte sua, il glucosio è il composto principale. Molti batteri hanno la capacità di metabolizzare il glucosio e formare acido piruvico.
L'acido piruvico è un punto intermedio nel metabolismo del glucosio e da lì ogni microrganismo può prendere strade diverse. Alcuni formeranno acidi misti, come acido lattico, acido acetico, acido formico e acido succinico, e altri formeranno prodotti neutri come il 2,3-butandiolo..
Il test di Voges-Proskauer rivela la capacità del microrganismo di formare acetil metil carbinolo (acetoina), un prodotto intermedio del 2,3-butandiolo in condizioni aerobiche.
L'acetoina è ridotta e forma 2,3-butandiolo, ma questa reazione è reversibile, quindi se il 2,3-butandiolo viene ossidato, si forma acetoina. Pertanto, l'ossigeno è essenziale.
Il fosfato dipotassico è il tampone che tampona la miscela a pH 6,9 ± 0,2.
Per dimostrare la reazione, è necessario eseguire uno sviluppo utilizzando due reagenti (reagenti Barrit), noti come Voges A e Voges B.
Voges A è una soluzione al 5% di α-naftolo e Voges B è un preparato di idrossido di potassio al 40%. Se l'idrossido di potassio non è disponibile, può essere sostituito con idrossido di sodio al 40%.
Α-Naphthol è un catalizzatore che aumenterà l'intensità del colore della reazione, rendendo il test più sensibile. L'α-naftolo deve essere sempre aggiunto per primo, agitando il tubo in modo che il mezzo venga a contatto con l'ossigeno. In questo modo, l'acetoina presente viene ossidata a diacetile e il 2,3-butandiolo viene ossidato per formare acetoina, passandola a diacetile..
È così che l'α-naftolo si legherà al diacetile, che a sua volta si è unito al nucleo guanidinico presente nell'amminoacido arginina, quest'ultimo proveniente dai pluripeptoni.
Da parte sua, l'idrossido di potassio o di sodio è responsabile dell'assorbimento di CODue e di reagire con i peptoni. Questa reazione provoca la formazione di un colore rosa salmone, ben visibile dopo aver agitato molto bene la provetta..
Le quantità corrette di diacetile, peptone e α-naftolo devono essere miscelate affinché il colore si manifesti istantaneamente. Se ciò non accade, il tubo viene lasciato riposare per 15 minuti prima dell'interpretazione..
Di solito il test è positivo dopo 2-5 minuti, quando è visibile un tenue colore rosa. Se lasciato riposare da 30 min a 1 ora l'intensità del colore sarà massima (rosso intenso).
Quando il brodo diventa giallo, verrà visualizzato un test negativo. Dopo 1 ora, se il test è negativo, si può formare un color rame a seguito della reazione dell'idrossido di potassio su α-naftolo.
Pesare 17 g del terreno di coltura disidratato e sciogliere in un litro di acqua distillata. Lasciar riposare per 5 minuti. Riscaldare a ebollizione per sciogliere completamente. Servire 3-4 ml in provette e sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti.
Il terreno di coltura disidratato è di colore beige e il terreno preparato è di colore ambra chiaro..
Il pH finale del mezzo è 6,9 ± 0,2.
Pesare 5 g di α-naftolo e sciogliere in 50 ml di alcol etilico (assoluto). Quindi continuare ad aggiungere alcol etilico fino a raggiungere i 100 ml..
Pesare 40 g di idrossido di potassio e sciogliere in 50 ml di acqua distillata in un becher. Il bicchiere deve essere posto a bagnomaria fredda per controllare la temperatura, perché quando il preparato è sciolto, la temperatura aumenta bruscamente.
Dopo che la soluzione è fredda, viene trasferita in un matraccio volumetrico e portata a 100 mL con acqua distillata..
Per eseguire il test Voges-Proskauer, un brodo RM / VP viene inoculato con il microrganismo in studio, da una coltura pura per 18-24 ore..
L'inoculo non dovrebbe essere molto denso. Viene incubato a 35-37 ° C per 24-48 ore, sebbene talvolta sia necessaria l'incubazione per diversi giorni. Cowan e Steel ritengono che 5 giorni sia il tempo minimo di incubazione necessario per rilevare tutte le specie Voges-Proskauer (VP) positive della famiglia delle Enterobacteriaceae..
Separare un'aliquota da 1 mL in una provetta e sviluppare come segue: Porre 12 gocce (0,6 mL) di reagente Voges A e 4 gocce (0,2 mL) di Voges B. Mescolare per aerare e lasciare riposare per 5-10 minuti prima di interpretare. Tuttavia, se il test è ancora negativo, lasciarlo riposare e osservare la provetta dopo 30 minuti a 1 ora..
La comparsa di un colore rosso-rosato indica che la reazione di Voges-Proskauer è positiva. Se il mezzo rimane giallo la reazione è negativa.
Aggiungere sviluppatori nell'ordine e nella quantità indicati è essenziale per evitare falsi negativi..
Il test di Voges-Proskauer è utile per differenziare i ceppi di E. coli che sono VP negativi, dei generi Klebsiella, Enterobacter, Serratia, tra gli altri, che sono VP positivi.
I ceppi di controllo possono essere utilizzati per testare la qualità del terreno preparato, incluso Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium e Enterobacter cloacae ATCC 13047.
I risultati attesi sono reazioni Voges-Proskauer positive solo per K. pneumoniae Y E. cloacae. Il resto dà reazioni negative.
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