Il endonucleasi sono enzimi che tagliano i legami fosfodiestere situati all'interno della catena nucleotidica. I siti di restrizione dell'endonucleasi sono molto vari. Alcuni di questi enzimi tagliano il DNA (acido desossiribonucleico, il nostro materiale genetico) quasi ovunque, cioè non sono specifici.
Al contrario, c'è un altro gruppo di endonucleasi che sono molto specifiche nella regione o nella sequenza che devono tagliare. Questo gruppo di enzimi è noto come enzimi di restrizione e sono molto utili in biologia molecolare. In questo gruppo abbiamo i noti enzimi Bam HI, Eco RI e Alu I..
Contrariamente alle endonucleasi, ci sono un altro tipo di proteine catalitiche - esonucleasi - che sono responsabili della rottura dei legami fosfodiestere alla fine della catena.
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Le endonucleasi di restrizione o gli enzimi di restrizione sono proteine catalitiche responsabili della scissione dei legami fosfodiestere all'interno della catena del DNA in sequenze molto specifiche.
Questi enzimi possono essere acquistati da più aziende biotecnologiche e il loro utilizzo è quasi essenziale nell'ambito delle attuali tecniche di manipolazione del DNA..
Le endonucleasi di restrizione sono denominate utilizzando le prime lettere del nome scientifico binomiale dell'organismo da cui provengono, seguite dal ceppo (questo è facoltativo) e terminano con il gruppo di enzimi di restrizione a cui appartengono. Ad esempio, Bam HI ed Eco RI sono endonucleasi ampiamente utilizzate..
La regione del DNA che l'enzima riconosce è chiamata sito di restrizione ed è unica per ciascuna endonucleasi, sebbene diversi enzimi possano coincidere nei siti di restrizione. Questo sito consiste generalmente in una breve sequenza palindromica di circa 4-6 paia di basi di lunghezza, come AGCT (per Alu I) e GAATTC per Eco RI..
Le sequenze palindromiche sono sequenze che, sebbene lette nella direzione da 5 'a 3' o da 3 'a 5', sono identiche. Ad esempio, per il caso di Eco RI, la sequenza palindromica è: GAATTC e CTTAAG.
Fortunatamente per i biologi molecolari, i batteri hanno sviluppato nel corso dell'evoluzione una serie di endonucleasi di restrizione che frammentano internamente il materiale genetico.
In natura, questi enzimi si sono evoluti - presumibilmente - come un sistema di protezione batterica contro l'invasione di molecole di DNA estranee, come quelle dei fagi.
Per discriminare tra materiale genetico nativo e estraneo, queste endonucleasi di restrizione possono riconoscere sequenze nucleotidiche specifiche. Pertanto, il DNA che non ha questa sequenza può essere indisturbato all'interno del batterio..
Al contrario, quando l'endonucleasi riconosce il sito di restrizione, si lega al DNA e lo taglia..
I biologi sono interessati a studiare il materiale genetico degli esseri viventi. Tuttavia, il DNA è costituito da diversi milioni di paia di basi di lunghezza. Queste molecole sono estremamente lunghe e devono essere analizzate in piccoli frammenti..
Per raggiungere questo obiettivo, le endonucleasi di restrizione sono integrate in vari protocolli di biologia molecolare. Ad esempio, un singolo gene può essere catturato e replicato per analisi future. Questo processo è chiamato "clonazione" di un gene..
I polimorfismi della lunghezza del frammento di restrizione si riferiscono al pattern di sequenze nucleotidiche specifiche nel DNA che le endonucleasi di restrizione sono in grado di riconoscere e tagliare.
Grazie alla specificità degli enzimi, ogni organismo è caratterizzato da uno specifico pattern di taglio nel DNA, originando frammenti di lunghezza variabile.
Storicamente, le endonucleasi di restrizione sono state classificate in tre tipi di enzimi, designati da numeri romani. Ultimamente è stato descritto un quarto tipo di endonucleasi.
La caratteristica più importante delle endonucleasi di tipo I è che sono proteine costituite da diverse subunità. Ognuna di queste funzioni come un singolo complesso proteico e di solito ha due subunità chiamate R, due M e una S.
La parte S è responsabile del riconoscimento del sito di restrizione nel DNA. La subunità R, da parte sua, è essenziale per la scissione e M è responsabile della catalizzazione della reazione di metilazione..
Esistono quattro sottocategorie di enzimi di tipo I, conosciuti con le lettere A, B, C e D, che sono di uso comune. Questa classificazione si basa sulla complementazione genetica.
Gli enzimi di tipo I sono stati le prime endonucleasi di restrizione ad essere scoperte e purificate. Tuttavia, i più utili in biologia molecolare sono il tipo II, che verrà descritto nella sezione successiva..
Le endonucleasi di restrizione di tipo II riconoscono specifiche sequenze di DNA e scissione in una posizione costante vicino a una sequenza che produce 5 'fosfati e 3' idrossili. Generalmente richiedono ioni magnesio (MgDue+), ma ce ne sono alcuni che hanno requisiti molto più specifici.
Strutturalmente, possono apparire come monomeri, dimeri o persino tetrameri. La tecnologia ricombinante utilizza endonucleasi di tipo II e per questo motivo sono stati caratterizzati più di 3.500 enzimi.
Questi sistemi enzimatici sono costituiti da due geni, chiamati mod Y Manzo, quel codice per le subunità che riconoscono il DNA e per modifiche o restrizioni. Entrambe le sotto-città sono necessarie per la restrizione, un processo totalmente dipendente dall'idrolisi dell'ATP..
Per scindere la molecola di DNA, l'enzima deve interagire con due copie della sequenza di riconoscimento non palindromica e i siti devono essere in un orientamento inverso sul substrato. La scissione è preceduta da una traslocazione del DNA.
Di recente è stato identificato un altro gruppo. Il sistema è composto da due o più geni che codificano per proteine che scindono solo sequenze di DNA modificate, glucosile metilato, idrossimetilato o idrometilato.
Ad esempio, l'enzima EckKMcrBC riconosce due dinucleotidi della forma generale RmC; una purina seguita da una citosina metilata, che può essere separata da diverse paia di basi - da 40 a quasi 3000. La scissione avviene a circa 30 paia di basi dietro il sito che l'enzima riconosce.
Le endonucleasi di questo tipo sono anche conosciute come endonucleasi "homing". Questi enzimi riconoscono e tagliano la sequenza del DNA bersaglio in siti unici nel genoma da 14 a 40 bp.
Questi enzimi sono spesso codificati negli introni e si ritiene che la loro funzione sia quella di promuovere il trasferimento orizzontale delle sequenze di taglio. Dopo il taglio, si verifica una riparazione della rottura nella doppia elica del DNA in base alla sequenza complementare.
Endonucleasi I di E. coli agisce come un sistema di difesa contro fagi e parassiti. Si trova principalmente tra la membrana citoplasmatica e la parete cellulare. Produce rotture a doppio filamento nel DNA estraneo con cui interagisce nello spazio periplasmatico.
Le endonucleasi CRISPR-Cas sono enzimi che agiscono sul meccanismo di difesa di molti tipi di batteri. Questi identificano e tagliano sequenze di DNA specifiche da organismi invasori, che sono generalmente virus.
Recentemente, i ricercatori del Massachusetts Institute of Technology (MIT) hanno scoperto il sistema di modifica del genoma CRISPR-Cas12bm con elevata precisione per la modifica delle cellule umane.
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