Il agar sangue è un terreno di coltura solido arricchito, differenziale ma non selettivo. Viene utilizzato per il recupero e la crescita di una grande varietà di microrganismi da campioni clinici o per sottoculture..
L'agar sangue classico dovrebbe essere incluso per la semina della maggior parte dei campioni clinici ricevuti in laboratorio; ad eccezione dei campioni di feci dove non è utile, a meno che non siano preparati con determinate modifiche.
Questo terreno di coltura è fondamentalmente costituito da una base agar arricchita e il 5% di sangue. La base dell'agar può variare in base alle esigenze, ma sarà composta principalmente da peptoni, amminoacidi, vitamine, estratto di carne, cloruro di sodio, agar, tra gli altri..
Per quanto riguarda il sangue, è normalmente richiesto il contatto con un vivaio per ottenere sangue da animali, come pecore, conigli o cavalli. Tuttavia, questo non è sempre possibile e talvolta viene utilizzato sangue umano..
Il terreno di agar sangue può essere preparato in laboratorio o può essere acquistato già pronto da aziende dedicate. La preparazione di questo terreno è una delle più delicate, qualsiasi disattenzione nella sua preparazione risulterà in un lotto contaminato.
Ecco perché devono essere prese tutte le precauzioni possibili e alla fine deve essere effettuato un controllo di qualità incubando a 37 ° C 1 piastra ogni 100 preparati.
Indice articolo
L'agar sangue è un terreno arricchito perché contiene il 5-10% di sangue su una base di agar come additivo principale. Entrambi i composti contengono molti nutrienti e questa proprietà consente alla maggior parte dei batteri coltivabili di crescere al suo interno..
Quella crescita avviene senza restrizioni; per questo motivo non è selettivo. Tuttavia, se a questo terreno vengono aggiunti composti che impediscono la crescita di alcuni microrganismi e favoriscono quella di altri, diventa selettivo. Questo è il caso se vengono aggiunti alcuni tipi di antibiotici o antimicotici.
Allo stesso modo, l'agar sangue è un mezzo differenziale, poiché ci consente di distinguere 3 tipi di batteri: beta-emolitico, alfa-emolitico e gamma-emolitico..
I beta-emolitici sono quelli che hanno la capacità di lisare o rompere completamente i globuli rossi, formando un alone chiaro attorno alle colonie, quindi producono ß o ß-emolisi ei microrganismi sono chiamati ß-emolitici..
Esempi di batteri ß-emolitici sono Streptococcus pyogenes Y Streptococcus agalactiae.
Gli alfa-emolitici sono quelli che effettuano l'emolisi parziale, dove l'emoglobina viene ossidata a metaemoglobina, generando una colorazione verdastra intorno alle colonie. Questo fenomeno è noto come α-emolisi o α-emolisi e i batteri sono classificati come α-emolitici..
Esempi di batteri α-emolitici sono Streptococcus pneumoniae Y Streptococco del gruppo viridans.
Infine, ci sono i cosiddetti batteri gamma-emolitici o non emolitici. Questi crescono sull'agar senza generare cambiamenti su di esso, un effetto noto come γ-emolisi, ei microrganismi sono γ-emolitici.
Esempio di batteri γ-emolitici: alcuni ceppi di streptococco di gruppo D (Streptococcus bovis e Enterococcus faecalis).
Il terreno di coltura dell'agar sangue è uno dei più comunemente utilizzati nel laboratorio di microbiologia..
Tra i microrganismi in grado di crescere nel mezzo agar sangue ci sono: batteri aerobi stretti, facoltativi, microaerofili, anaerobici, Gram positivi o Gram negativi, batteri a crescita rapida o lenta.
Crescono anche batteri esigenti o nutrizionalmente esigenti, funghi e lieviti. Allo stesso modo, è utile eseguire sottocolture o riattivare ceppi metabolicamente molto deboli..
Tuttavia, la scelta del gruppo sanguigno e dell'agar base varierà a seconda del probabile microrganismo sospettato di guarigione e dell'uso che verrà somministrato alla piastra (coltura o antibiogramma)..
Il sangue può essere di agnello, coniglio, cavallo o umano.
Il più consigliato è il sangue di agnello, con alcune eccezioni. Ad esempio, per isolare le specie Haemophilus, dove il sangue raccomandato è sangue di cavallo o di coniglio, poiché il sangue di agnello ha enzimi che inibiscono il fattore V.
Il meno consigliato è umano, tuttavia è il più utilizzato, forse perché è il più facile da ottenere.
Il sangue deve essere defibrinato, ottenuto senza alcun tipo di additivo e da animali sani. Per l'uso del sangue umano, è necessario tenere conto di diversi fattori:
Se il sangue proviene da individui che hanno avuto infezioni batteriche, avranno anticorpi specifici. In queste condizioni, è probabile che la crescita di alcuni batteri venga inibita..
Se è ottenuto dalla banca del sangue, contiene citrato e alcuni batteri potrebbero non crescere in sua presenza. D'altra parte, se il sangue proviene da pazienti che assumono antibiotici, la crescita di batteri sensibili può essere inibita..
E se il sangue proviene da una persona diabetica, il glucosio in eccesso interferisce con il corretto sviluppo dei modelli di emolisi.
L'agar base utilizzato per la preparazione dell'agar sangue può essere molto ampio. Tra questi ci sono: agar nutriente, agar per infusione di cuore cerebrale, agar tripticasi di soia, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin, agar Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter, ecc..
Questa base è la meno utilizzata, poiché crescerà principalmente batteri non esigenti, come i bacilli enterici., Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, tra gli altri. Non è consigliabile isolare lo streptococco.
È uno dei più usati come base di agar sangue, perché contiene i nutrienti necessari per la crescita della maggior parte dei batteri, tra cui Streptococcus sp e altri batteri esigenti. Sebbene non sia adatto per l'osservazione dei modelli di emolisi.
Il sangue di agnello viene generalmente utilizzato con questa base.
Possono anche essere preparate varianti di agar sangue, in cui vengono aggiunti altri composti per isolare alcuni microrganismi. Ad esempio, l'agar per infusione cervello-cuore integrato con sangue di coniglio, cistina e glucosio, serve per isolare Francisella tularensis.
Considerando che con la cistina tellurite è utile per l'isolamento di Corynebacterium diphteriae. È possibile utilizzare sangue umano o di agnello.
Con la prima beta-emolisi sarà visto come un alone stretto, mentre con la seconda l'alone sarà molto più ampio.
Allo stesso modo, questa base insieme a bacitracina, amido di mais, sangue di cavallo e altri integratori di arricchimento (IsoVitaleX), viene utilizzata per l'isolamento del genere Haemophilus sp da campioni respiratori.
Inoltre, se viene aggiunta la combinazione di antibiotici cloramfenicolo - gentamicina o penicillina - streptomicina con sangue di cavallo, è ideale per l'isolamento di funghi patogeni esigenti, anche con una resa maggiore rispetto all'agar glucosio Sabouraud. È particolarmente utile per isolare Histoplasma capsulatum.
Questa base è la più consigliata per una migliore osservazione del pattern di emolisi e per eseguire test diagnostici come taxa optochina e bacitracina. È il classico agar sangue utilizzato di routine.
Con questa base puoi anche preparare lo speciale agar sangue per Corynebacterium diphteriae, con cistina tellurite Y sangue di agnello.
Allo stesso modo, la combinazione di questo agar con sangue di agnello, più kanamicina-vancomicina è ideale per la crescita degli anaerobi, in particolare Bacteroides sp.
Questa base integrata con sangue viene utilizzata per eseguire l'antibiogramma di microrganismi esigenti, come Streptococcus sp.
È utile anche per l'isolamento di batteri come Legionella pneumophila.
Questo terreno è ideale come base per l'agar sangue quando si sospetta il genere Neisseria, in particolare Neisseria meningitidis, come N. gonorrhoeae non cresce su agar sangue.
Viene anche utilizzato per eseguire test di suscettibilità a Neisseria meningitidis.
Questa base è eccellente per la semina di campioni da biopsia gastrica Helicobacter pylori.
Il terreno viene preparato aggiungendo il 7% di sangue di agnello defibrinato con antibiotici (vancomicina, trimetoprim, amfotericina B e cefsulodina) per limitare la crescita di altri tipi di batteri che possono essere presenti..
Questa stessa base integrata con sangue umano o di agnello, acido nalidixico e colistina è utile per isolare Gardnerella vaginalis. Ideale anche per valutare la suscettibilità antimicrobica agli antibiotici dello stesso microrganismo.
Inoltre, viene utilizzato per la preparazione di agar sangue per la coltivazione di anaerobi, aggiungendo aminoglicosidi e vancomicina..
Questa base consente di osservare correttamente gli schemi di emolisi.
Questo terreno utilizzato come base per l'agar sangue insieme all'aggiunta di vitamina K è ideale per la coltivazione di batteri anaerobici. In questo caso si consiglia l'uso di sangue di agnello..
L'agar Campylobacter integrato con il 5% di sangue di pecora e 5 antibiotici (cefalotina, amfotericina B, trimetoprim, polimixina B e vancomicina) è il terreno utilizzato per isolare Campylobacter jejuni in campioni di feci.
Ogni casa commerciale porta le istruzioni per preparare un litro di terreno di coltura sul retro del contenitore. È possibile eseguire i calcoli corrispondenti per preparare la quantità desiderata, a seconda dell'agar base selezionato.
L'agar base è disidratato (polvere), quindi deve essere sciolto in acqua distillata a pH 7,3.
La quantità indicata dalla base agar scelta viene pesata e sciolta nella corrispondente quantità di acqua in un pallone, quindi riscaldata a fuoco moderato e miscelata con movimenti rotatori fino a quando tutta la polvere è sciolta..
Una volta sciolto, sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 20 minuti.
All'uscita dall'autoclave il pallone viene lasciato raffreddare fino a quando la temperatura oscilla tra 40 e 50 ° C; È una temperatura che la pelle umana sopporta e allo stesso tempo l'agar non si è ancora solidificato.
Per fare questo si tocca con la mano il pallone e se il calore è tollerabile, è la temperatura ideale per aggiungere la corrispondente quantità di sangue defibrinato (50 ml per ogni litro di agar). Mescolare delicatamente per omogeneizzare.
Il passaggio dell'aggregazione sanguigna è cruciale, perché se viene fatto quando il mezzo è molto caldo i globuli rossi si romperanno e il mezzo non servirà per osservare l'emolisi.
Se aggiunto troppo freddo, si formeranno grumi e la superficie del supporto non sarà liscia per consentire una corretta incisione..
Servire in piastre Petri sterili subito dopo aver omogeneizzato il sangue. Circa 20 ml vengono versati in ciascuna capsula di Petri. Questa procedura viene eseguita in una cappa a flusso laminare o vicino al bruciatore.
Quando si serve l'agar sangue nelle piastre Petri, non devono rimanere bolle d'aria sulla superficie della piastra. Se questo accade, la fiamma del becco Bunsen viene passata velocemente sulla piastra per eliminarli..
Le piastre vengono lasciate solidificare e conservate in frigorifero (2-8 ° C) capovolte fino al momento dell'uso. Prima di utilizzare le piastre di agar sangue, devono essere temperate (lasciate che raggiungano la temperatura ambiente) per poter essere seminate..
I piatti preparati durano circa 1 settimana.
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