Il Agar Sabouraud, noto anche come agar destrosio Sabouraud, è un terreno di coltura solido, particolarmente arricchito per l'isolamento e lo sviluppo di funghi, come lieviti, muffe e dermatofiti..
Pertanto, questo terreno non può mancare in un laboratorio di microbiologia per indagare la presenza di funghi patogeni o opportunisti, sia da campioni clinici che non clinici. Allo stesso modo, è anche ideale per la crescita di batteri filamentosi come Streptomyces e Nocardias. Il suo utilizzo è molto ampio, in quanto può essere utilizzato nella micologia umana, animale, vegetale e industriale.
Questo terreno è stato creato nel 1896 dal famoso dermatologo Raimond Sabouraud, che divenne uno specialista di fama mondiale in disturbi del cuoio capelluto, principalmente causati da dermatofiti..
La sua creazione è stata così importante che è stata utilizzata da allora e rimane ancora oggi, anche se con alcune modifiche.
Sebbene sia speciale per i funghi, i batteri possono crescere in questo terreno, quindi, per i campioni con flora mista, è richiesta l'inclusione di antibiotici nella loro preparazione e quindi inibisce la crescita della flora batterica che può essere presente..
La scelta dell'antibiotico deve essere fatta con attenzione e tenendo conto del tipo di fungo da recuperare, poiché alcuni sono inibiti in presenza di determinate sostanze.
Indice articolo
L'agar destrosio Sabouraud è un terreno che nella sua formulazione originale è debolmente selettivo, a causa del suo pH acido di 5,6 ± 0,2, tuttavia i batteri possono ancora svilupparsi, principalmente in incubazioni prolungate.
Il terreno contiene peptone di caseina e digestato pancreatico di tessuto animale, che forniscono la fonte di carbonio e azoto per la crescita di microrganismi..
Contiene anche un'alta concentrazione di glucosio, che funge da fonte di energia, favorendo la crescita dei funghi sui batteri. Il tutto miscelato con agar-agar, componente che gli conferisce la giusta consistenza..
D'altra parte, l'agar destrosio Sabouraud può essere selettivo se vengono aggiunti antibiotici..
Con gli antibiotici è particolarmente utile in campioni di ferite, ulcere aperte o qualsiasi campione in cui si sospetta una forte contaminazione batterica.
-Agar Sabouraud con cloramfenicolo: ideale per il recupero di lieviti e funghi filamentosi.
-Agar Sabouraud con gentamicina e cloramfenicolo: quasi tutti i funghi e lieviti filamentosi crescono su questo terreno e inibisce un gran numero di batteri, inclusi Enterobacteriaceae, Pseudomonas e Staphylococcus.
-Agar Sabouraud con cicloesimide: è particolarmente utile per i campioni della pelle o delle vie respiratorie, purché il sospetto sia funghi dimorfici.
La cicloesimide deve essere usata con cautela; Sebbene sia usato per inibire la crescita di funghi e lieviti non patogeni o ambientali che possono essere presenti come contaminanti in un campione, inibisce anche la crescita di alcuni funghi come Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp e altri funghi opportunistici.
-Agar Sabouraud con cloramfenicolo più cicloesimide: utilizzato principalmente per isolare dermatofiti e funghi dimorfici. Ha lo svantaggio di inibire alcune specie di funghi opportunisti come Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes o C.. neoformans.
-Agar Sabouraud con cloramfenicolo, streptomicina, penicillina G e cicloesimide: è ideale per campioni estremamente contaminati da batteri e funghi saprofiti, ma ha lo svantaggio di inibire la crescita di Actinomyces e Nocardias, oltre ai funghi opportunistici sopra menzionati.
Se hai gli ingredienti separatamente, può essere preparato come segue:
Pesare:
- 40 gr di destrosio
- 10 g di peptone
- 15 gr di agar-agar
- Misura 1000 ml di acqua distillata
Tutti gli ingredienti sono miscelati, il pH è regolato a 5,6. I soluti vengono sciolti per ebollizione, 20 ml del terreno vengono distribuiti in tubi da 25 x 150 mm, senza bordo e preferibilmente con un cappuccio di cotone..
È possibile utilizzare anche altre dimensioni di tubo, a seconda della disponibilità.
Vengono sterilizzati in autoclave per 10 minuti a pressione atmosferica (121 ° C). Il tempo di sterilizzazione in autoclave non deve essere superato. All'uscita dall'autoclave, i tubi vengono inclinati con l'aiuto di un supporto fino a solidificarsi in una punta di flauto..
Un altro modo è sciogliere gli ingredienti riscaldando fino all'ebollizione. Nella stessa beuta, sterilizzare in autoclave per 10 minuti e poi distribuire 20 ml in piastre Petri..
Se si dispone di un terreno agar destrosio Sabouraud che contiene già tutti gli ingredienti, procedere a pesare la quantità specificata dalla società commerciale per un litro d'acqua. Gli altri passaggi sono gli stessi descritti sopra.
Pesare:
- 20 gr di destrosio
- 10 g di peptone
- 17 gr di agar-agar
- Misura 1000 ml di acqua distillata
Tutti gli ingredienti vengono miscelati, il pH viene regolato a 6,9. Procedi come nel caso precedente.
Ci sono case commerciali che offrono il mezzo con tutti gli ingredienti. In questo caso, pesare e preparare come descritto sull'inserto..
- Pesare 500 mg di base cloramfenicolo
- Misura 100 ml di etanolo al 95%
- Mescolare
Il terreno Sabouraud destrosio agar (Emmons) viene preparato come descritto in precedenza e in aggiunta per ogni litro di terreno aggiungere 10 ml di soluzione madre di cloramfenicolo prima della sterilizzazione in autoclave..
- Pesare 5 g di cicloesimide
- Misura 100 ml di acetone
- Mescolare
Il terreno agar destrosio Sabouraud (Emmons) viene preparato come descritto in precedenza e in aggiunta per ogni litro di terreno aggiungere 10 ml di soluzione madre di cicloesimide prima della sterilizzazione in autoclave..
Il terreno agar destrosio Sabouraud (Emmons) viene preparato come già descritto e in aggiunta per ogni litro di terreno aggiungere 10 ml di soluzione madre di cloramfenicolo e 10 ml di soluzione madre di cicloesimide prima della sterilizzazione in autoclave..
Da 20.000 a 60.000 unità di penicillina per litro di terreno.
30 mg di streptomicina per litro di terreno.
Entrambi devono essere incorporati dopo che il mezzo è stato autoclavato, leggermente raffreddato (50-55 ° C).
0,04 g di neomicina per litro di terreno.
0,04 g di gentamicina per litro di terreno.
Per sicurezza, si preferisce seminare l'agar con destrosio Sabouraud in provette a cuneo (inclinate nel becco della scanalatura) piuttosto che in piastre di Petri, per evitare la dispersione e l'inalazione di spore.
È importante che le provette di agar Sabouraud siano coperte con cotone e non con tappo a vite, poiché è stato dimostrato che le condizioni semi-anaerobiche inibiscono la formazione di spore in alcuni ceppi, ad esempio Coccidioides immitis. Inoltre, la maggior parte dei funghi è aerobica..
In caso di utilizzo del tappo a vite, non chiudere ermeticamente.
I supporti preparati devono essere sottoposti a un controllo di qualità per verificarne il corretto funzionamento. Per questo, vengono seminati alcuni ceppi di controllo.
Per Sabouraud destrosio agar con cloramfenicolo, ceppi ATCC di candida albicans, che deve avere una crescita eccellente. Un'altra piastra viene inoculata con ceppi Escherichia coli, deve essere completamente inibito.
Viene inoltre incubata una piastra non inoculata in cui non devono crescere microrganismi..
Per Sabouraud destrosio agar con cloramfenicolo e cicloesimide, ceppi di Trichophyton mentagrophytes, dovrebbe svilupparsi bene. Un'altra piastra viene inoculata con un ceppo di Aspergillus flavus, in cui deve esserci poca o nessuna crescita. Inoltre, una piastra non inoculata viene incubata per dimostrarne la sterilità..
Per Sabouraud destrosio agar con cicloesimide, ceppi di candida albicans, Trichophyton rubrum o Microsporum canis, che deve mostrare una buona crescita.
Allo stesso modo, un ceppo di Aspergillus flavus, mostrando poca o nessuna crescita. Infine incubare una piastra non inoculata per il controllo della sterilità..
L'agar destrosio Sabouraud classico contiene 4 grammi di destrosio ed è eccellente come mezzo di isolamento primario, poiché mostra la morfologia caratteristica di ciascun fungo..
È anche eccellente per dimostrare la produzione di pigmenti. Tuttavia, non è il mezzo più adatto per osservare la sporulazione..
Inoltre, non è raccomandato per la crescita Blastomyces dermatitidis, che è inibito dall'elevata concentrazione di glucosio presente.
D'altra parte, per la coltivazione è necessario tenere conto di alcune considerazioni.
Alcuni funghi crescono meglio a temperatura ambiente, come le muffe, altri crescono con successo a 37 ° C, come alcuni lieviti, e altri possono crescere a entrambe le temperature (funghi dimorfici).
Per questo motivo, a volte è necessario utilizzare più piastre di agar Sabouraud per lo stesso campione, poiché spesso viene eseguita la semina in duplicato per incubare una piastra a temperatura ambiente e un'altra a 37 ° C..
Per esempio, Sporothrix schenckii si semina in due piatti; uno viene incubato a temperatura ambiente per ottenere la fase di muffa e l'altro viene incubato a 37 ° C per ottenere la fase di lievito, ma in quest'ultimo è necessario aggiungere il 5% di sangue al terreno.
In altri casi, come i campioni di micetoma, vengono seminate due piastre di agar Sabouraud, una con cloramfenicolo e l'altra con cicloesimide. Il primo consentirà la crescita di agenti causali del micetoma di origine fungina (Eumycetoma) e il secondo agenti causali del micetoma di origine batterica, come gli actinomicetomi..
L'agar destrosio Sabouraud modificato da Emmons contiene 2 grammi di destrosio e non viene utilizzato solo per l'isolamento, ma anche per la sporulazione e la conservazione dei funghi.
In questo mezzo, se ceppi di Blastomyces dermatitidis.
Per conservare le colture di funghi, possono essere conservate in frigorifero (2-8 ° C). Il tempo di conservazione può variare dalle 2 alle 8 settimane. Trascorso questo tempo devono essere sottocolturati per ripetere il processo..
Alcuni funghi si conservano meglio a temperatura ambiente, come Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum Y Microsporum audounii.
Il mantenimento del ceppo può essere allungato per evitare il pleomorfismo se il destrosio è completamente eliminato dall'agar e se la quantità di agar nel terreno è ridotta per evitare la secchezza.
Per l'identificazione di alcuni funghi filamentosi, è necessario eseguire microcolture utilizzando l'agar Sabouraud o altri mezzi speciali per osservare le strutture della riproduzione sessuale e asessuata..
Viene utilizzato principalmente per la diagnosi di malattie fungine, in particolare quelle che colpiscono la pelle e le sue attaccature (capelli e unghie).
I campioni possono essere secrezioni, essudati, pelle, capelli, unghie, espettorato, liquido cerebrospinale o urina. Gli agenti patogeni comunemente isolati sono dermatofiti, funghi che causano micosi sottocutanee e sistemiche..
Gli animali sono spesso colpiti da infezioni fungine, quindi l'agar Sabouraud è utile nella micologia animale come lo è negli esseri umani..
Ad esempio, i dermatofiti possono spesso colpire gli animali. Questo è il caso di Microsporum canis var distorsum, Infetta frequentemente cani, gatti, cavalli, maiali e scimmie. allo stesso modo, Microsporum gypseum infetta cani, gatti e bestiame.
Gli uccelli come polli, galli e galline ne sono colpiti Microsporum gallinae.
Altri funghi, come Zymonema farciminosum, Sono anche causa di malattie negli animali, principalmente cavalli, muli e asini, provocando una significativa infiammazione dei vasi linfatici..
Sporothrix schenkii e Histoplasma capsulatum colpiscono gli animali domestici e gli esseri umani.
Molti funghi patogeni o opportunistici possono concentrarsi in un dato momento in un dato ambiente, specialmente nelle sale operatorie e nelle unità di terapia intensiva (ICU) di cliniche e ospedali. Perciò è necessario effettuarne un controllo.
Altri spazi vulnerabili sono biblioteche e vecchi edifici, che possono essere influenzati dalla concentrazione di funghi ambientali.
Negli studi ambientali, l'agar destrosio Sabouraud viene utilizzato per l'isolamento dei funghi..
L'agar destrosio Sabouraud non può mancare per lo studio dei funghi contaminanti nella produzione di cosmetici, alimenti, bevande, cuoio, tessuti, tra gli altri..
Le piante soffrono anche di malattie causate da funghi, che colpiscono diverse parti della pianta, che possono anche terminare il raccolto, causando grandi perdite in agricoltura..
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