Il agar M.R.S. è un terreno di coltura solido selettivo, utilizzato per l'isolamento e il conteggio dei batteri lattici, in particolare del genere Lactobacillus. Questo agar è stato creato nel 1960 da Man, Rogosa e Sharpe, con lo stesso nome, ma per la sua complessità viene spesso utilizzata l'abbreviazione M.R.S..
È composto da peptone proteico, estratto di carne, estratto di lievito, glucosio, monoleato di sorbitano, fosfato dipotassico, acetato di sodio, citrato di ammonio, solfato di magnesio, solfato di manganese e agar..
Questa composizione consente il corretto sviluppo dei batteri lattici da campioni clinici, come feci, perdite vaginali, campioni orali e latte materno, nonché latticini e alimenti a base di carne.
Non viene utilizzato di routine nei laboratori clinici, perché i batteri dell'acido lattico sono raramente coinvolti nei processi patologici. Tuttavia, nell'ambito della microbiologia alimentare, l'uso dell'agar M.R.S è più frequente..
Questo terreno è invece utilizzato da alcuni Centri di Ricerca il cui obiettivo è lo studio dei batteri lattici..
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L'agar Man, Rogosa e Sharpe ha una composizione abbastanza complessa. Scomponendo la funzione di ciascuno dei suoi componenti, è possibile spiegarne le basi.
Il peptone proteico, l'estratto di carne, l'estratto di lievito e il glucosio sono nutrienti che forniscono la fonte di carbonio, azoto, vitamine e minerali necessari per la crescita batterica. Inoltre, il glucosio è la fonte energetica universale utilizzata nella maggior parte dei terreni di coltura..
D'altra parte, per favorire la crescita dei batteri lattici, è necessaria la presenza di cofattori (cationi) essenziali nel metabolismo del Lactobacillus e dei batteri correlati; questi composti sono i sali di sodio, magnesio e manganese.
Allo stesso modo, il monoleato di sorbitano o il polisorbato 80 sono un'importante fonte di acidi grassi poiché vengono assorbiti come nutrienti..
Inoltre, il monoleato di sorbitano e il citrato di ammonio agiscono inibendo lo sviluppo della flora di accompagnamento, in particolare i batteri Gram negativi, fornendo il carattere selettivo di questo agar..
Infine, l'agar-agar è quello che fornisce la consistenza solida al terreno.
Esistono altre varianti dell'agar Man Rogosa Sharpe; uno di questi è integrato con cisteina (M.R.S.c), molto utile per l'isolamento dei bifidobatteri, tra gli altri microrganismi. D'altra parte, c'è il terreno MRS integrato con neomicina, paromomicina, acido nalidixico e cloruro di litio, in particolare per il conteggio selettivo dei bifidobatteri nei prodotti lattiero-caseari..
Pesare 68,25 grammi del mezzo disidratato e sciogliere in un litro di acqua distillata. Lasciar riposare per 5 minuti. Per dissolverlo completamente, passare a una fonte di calore, mescolando frequentemente e far bollire per 1 o 2 minuti. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti.
Quando si lascia l'autoclave, lasciare riposare per alcuni minuti e distribuire ancora caldo in piastre Petri sterili..
Consentire ai piatti di solidificarsi e capovolgere i piatti, ordinare in griglie per piatti e conservare in frigorifero fino al momento dell'uso. Lasciare che le piastre raggiungano la temperatura ambiente prima dell'uso.
Il pH del mezzo dovrebbe essere 6,4 ± 0,2. Alcune case commerciali raccomandano un pH compreso tra 5,5 e 5,9.
Il terreno disidratato è beige e preparato è di colore ambra scuro.
Sia il terreno disidratato che le piastre preparate devono essere conservati a 2-8 ° C..
Il M.R.S. Possono essere seminati in superficie (ad esaurimento o con spatola Drigalski). Può anche essere seminato in profondità. Le piastre devono essere incubate a 37 ° C in microaerofilia (4% ODue e 5-10% di CODue) per 24-72 ore.
Il metodo di semina viene scelto in base allo scopo perseguito (isolamento o conteggio).
Le colonie presunte di Lactobacillus crescono di colore biancastro e hanno un aspetto mucoso o cremoso su questo agar. Successivamente devono essere identificati.
Per questo, viene utilizzata la semina superficiale. I campioni da seminare richiedono una procedura precedente.
Nel caso di campioni di latte materno, si consiglia di centrifugare 1 ml del campione a 14.000 rpm per 10 minuti, al fine di rimuovere lo strato di grasso. 900 µl vengono scartati e nei restanti 100 µl il pellet viene sospeso e versato sulla superficie del M.R.S. Dovrebbe quindi essere distribuito uniformemente con una spatola Drigalski..
Nel caso di campioni di feci, un (1) grammo di feci viene pesato e omogeneizzato in 9 mL di acqua peptone sterile allo 0,1%, corrispondente a una diluizione 1/10. Quindi vengono effettuate diluizioni seriali, fino a una diluizione finale di 10-4.
Infine vengono prelevati 100 μl delle 10 diluizioni-Due, 10-3 e 10-4 e ogni diluizione viene seminata su agar MRS, distribuendo uniformemente con una spatola Drigalski.
In questo caso la semina avviene in profondità.
Per i campioni di latte materno, 1 mL viene prelevato e posto in un tubo di plastica conico sterile. L'agar MRS viene aggiunto ad una temperatura di circa 40 ° C ad un volume finale di 25 mL, ottenendo una miscela omogenea. Successivamente, viene versato in piastre Petri sterili in modo uniforme e lasciato riposare fino alla polimerizzazione..
Per i campioni di feci, vengono effettuate le diluizioni, come descritto in precedenza. Prendi 1 mL di ciascuna diluizione e mettilo in provette di plastica coniche sterili. L'agar MRS fuso viene aggiunto a un volume di 25 mL.
La miscela di ciascuna diluizione viene versata in modo uniforme in piastre Petri sterili. Infine si lascia riposare fino alla sua polimerizzazione.
Ogni giorno lo studio dei batteri lattici sta guadagnando sempre più interesse; I ricercatori cercano in particolare di conoscere nuovi ceppi e il loro potenziale come fermenti di avviamento per la standardizzazione nella produzione di prodotti lattiero-caseari, tra gli altri usi..
In questo senso, Alvarado et al. (2007) ha utilizzato M.R.S. per condurre uno studio in cui hanno isolato, identificato e caratterizzato i batteri lattici presenti in un formaggio venezuelano affumicato andino artigianale.
Nel formaggio hanno riscontrato la presenza di batteri dei generi Lactococcus e Lactobacillus e hanno concluso che le miscele di ceppi isolati sono adatte come ceppi iniziali nella produzione di formaggio da latte pastorizzato..
D'altra parte, Sánchez et al. (2017) ha utilizzato M.R.S. indagare la presenza di batteri lattici nel tratto digerente dei suinetti, al fine di utilizzarli come probiotici nativi che aumentano la produttività dei suinetti sani.
Con questo mezzo sono riusciti a isolare quattro specie: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae Y Pediococcus pentosaceus.
Allo stesso modo, Báez et al. (2019) ha utilizzato M.R.S. per valutare batteri lattici (LAB) e bifidobatteri con potenziale probiotico nel latte materno e nelle feci dei neonati.
Sono riusciti a isolare 11 BAL e 3 Bifidobacteria sp nel latte materno e 8 BAL e 2 Bifidobacteria sp. nelle feci. Tutti hanno soddisfatto determinati parametri che li dimostrano come batteri con attività probiotica.
Gli autori hanno concluso che sia il latte materno che le feci dei bambini allattati esclusivamente al seno fungono da fonti naturali di batteri probiotici..
Per valutare la qualità di M.R.S. Ceppi di controllo come:
Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum E questo è il 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli e Bacillus cereus.
I risultati attesi sono una crescita soddisfacente per i primi 6 batteri, intanto E. coli Y Bacillus cereus deve essere completamente inibito.
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