Il DNA ricombinante (RDNA o rDNA) è una molecola di acido nucleico artificiale creata in laboratorio integrando segmenti di interesse di due organismi. È anche noto come DNA chimerico, grazie alla sua proprietà ibrida. Questo tipo di DNA non si trova in natura.
La metodologia di base per generarlo include: (a) la selezione di un DNA bersaglio e il suo inserimento in un altro frammento di DNA (generalmente un plasmide batterico); (b) l'introduzione di questo plasmide in un batterio, (c) la selezione dei batteri mediante antibiotici e infine (d) l'espressione del gene.
La tecnica si avvale di una serie di enzimi che consentono di copiare e incollare specifici frammenti di DNA secondo il giudizio del ricercatore..
L'obiettivo della tecnologia ricombinante è, nella maggior parte dei casi, l'espressione di una proteina (nota come proteina ricombinante) desiderata dal biologo molecolare per ricerche future o per creare una proteina di valore commerciale e terapeutico, come ad esempio l'insulina umana..
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Tutti gli esseri organici che conosciamo condividono diverse caratteristiche. Uno di questi è la natura del materiale genetico e il modo in cui vengono prodotte le proteine, un processo noto come il "dogma" centrale della biologia molecolare..
Ad eccezione di un paio di virus, tutti gli organismi immagazzinano informazioni genetiche nel DNA (acido desossiribonucleico), raccolto in modo molto compatto e organizzato nel nucleo della cellula..
Per l'espressione genica, la molecola di DNA viene trascritta nell'RNA messaggero e quest'ultimo viene tradotto nel linguaggio degli amminoacidi, i mattoni delle proteine..
Tra gli anni '70 e '80 i biologi molecolari iniziarono a sfruttare i processi che avvengono naturalmente all'interno della cellula e furono in grado di estrapolarli in laboratorio.
In questo modo, un gene di origine animale (un vertebrato, per esempio) potrebbe essere inserito in un segmento di DNA di un batterio; oppure il DNA di un batterio potrebbe essere combinato con un DNA virale. Quindi, possiamo definire un DNA ricombinante come una molecola composta da DNA di due diversi organismi..
Una volta creata questa molecola ibrida o ricombinante, viene espresso il gene di interesse. Con la parola espressione vogliamo riferirci al processo di traduzione in proteina.
Un elemento chiave nello sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante è stata la scoperta degli enzimi di restrizione..
Si tratta di molecole proteiche che mostrano la capacità di scindere il DNA (nucleasi) in sequenze specifiche, fungendo da "forbici molecolari". I frammenti generati da questi enzimi sono chiamati frammenti di restrizione.
Detti enzimi possono produrre tagli simmetrici nella sequenza target (in entrambe le catene alla stessa altezza) o tagli asimmetrici. Un aspetto chiave dell'azione degli enzimi di restrizione è che dopo la scissione delle catene, si ottiene un "bordo libero", complementare all'altro bordo tagliato dallo stesso enzima..
Alcuni esempi sono ECOR 1 e Sma 1. Attualmente sono noti e disponibili in commercio più di 200 tipi di enzimi di restrizione..
Per essere utile, una forbice deve essere accompagnata dalla colla. Questa azione sigillante del DNA (precedentemente trattato con enzimi di restrizione) è svolta dalle ligasi.
Di seguito descriveremo i passaggi principali richiesti dalla tecnologia del DNA ricombinante. Tutti sono svolti da professionisti in un laboratorio di biologia molecolare.
Prima di proseguire con il protocollo sperimentale, dobbiamo notare che in biologia molecolare e biotecnologia sono ampiamente utilizzati il termine "clone" e il verbo "clone". Ciò potrebbe creare confusione.
In questo contesto, non ci riferiamo alla clonazione di qualunque cosa un organismo (come nel caso della famosa pecora Dolly, per esempio), ma alla clonazione di un frammento di DNA, che può essere un gene. Cioè, produrre molte copie - geneticamente identiche - della sequenza.
Il primo passo è decidere quale sequenza utilizzare. Questo dipende totalmente dal ricercatore e dagli obiettivi del suo lavoro. Questo DNA deve quindi essere isolato e purificato. I metodi e le procedure per ottenere ciò dipendono a loro volta dal corpo e dai tessuti.
Generalmente, un pezzo di tessuto viene prelevato e sottoposto a trattamento in un tampone di lisi con proteinasi K (un enzima proteolitico) e quindi viene estratto il DNA. Successivamente, il materiale genetico viene frammentato in piccoli frammenti.
Dopo i passaggi preparatori, il ricercatore cerca di introdurre il segmento di DNA di interesse in un vettore di clonazione. D'ora in poi chiameremo questo segmento di DNA DNA bianco.
Uno dei vettori più utilizzati in un plasmide di origine batterica. Un plasmide è una molecola di DNA circolare a doppio filamento che si trova naturalmente nei batteri. Sono estranei al cromosoma batterico, cioè sono extracromosomici e si trovano naturalmente in questi procarioti.
Gli elementi di base di un vettore sono: (a) un'origine di replicazione, che consente la sintesi del DNA; (b) agente di selezione, che consente di identificare gli organismi che trasportano il plasmide con il DNA bersaglio, come la resistenza ad alcuni antibiotici; e (c) sito multicloning, dove si trovano le sequenze che saranno riconosciute dagli enzimi di restrizione..
Il primo DNA ricombinante riuscito in laboratorio è stato clonato nel plasmide pSC101 dal batterio E. coli. Contiene un sito di restrizione per l'enzima di restrizione EcoRI e un gene di resistenza agli antibiotici, oltre all'origine della replicazione..
L'inserimento del DNA bersaglio nel plasmide viene effettuato utilizzando gli strumenti molecolari degli enzimi di restrizione e delle ligasi descritti nella sezione precedente..
Oltre ai plasmidi, il DNA può essere inserito in un altro vettore, come lambda batteriofago, cosmidi, YAC (cromosomi artificiali di lievito), BAC (cromosomi artificiali batterici) e fagemidi..
Una volta ottenuta la molecola di DNA ricombinante (gene di interesse nel plasmide o altro vettore), viene introdotta in un ospite o organismo ospite, che può essere un batterio..
Per introdurre DNA estraneo in un batterio, viene utilizzata una tecnica chiamata trasformazione batterica, in cui l'organismo viene sottoposto a un trattamento con cationi bivalenti che lo rende suscettibile all'assorbimento del DNA..
Metodologicamente, non possiamo garantire che il 100% dei batteri nella nostra coltura abbia effettivamente assorbito la nostra molecola di DNA ricombinante. È qui che entra in gioco la porzione del plasmide che contiene la resistenza agli antibiotici..
Pertanto, i batteri che hanno assorbito il plasmide saranno resistenti a un certo antibiotico. Per selezionarli basterà applicare detto antibiotico e prelevare i sopravvissuti.
Dopo aver selezionato i batteri con il nostro DNA ricombinante, procediamo a utilizzare il macchinario enzimatico dell'ospite per generare il prodotto proteico di interesse. Man mano che i batteri si riproducono, il plasmide viene trasmesso alla prole, quindi non viene perso durante la divisione..
Questa procedura utilizza i batteri come una sorta di "fabbrica" di proteine. Più avanti vedremo che è stata una procedura molto rilevante nello sviluppo di trattamenti medici efficaci..
Una volta che la coltura è pronta e i batteri hanno prodotto grandi quantità di proteine, la cellula viene lisata o interrotta. Esiste un'ampia gamma di tecniche biochimiche che consentono la purificazione delle proteine in base alle loro caratteristiche fisico-chimiche..
In un altro contesto sperimentale, potremmo non essere interessati a generare la proteina, ma piuttosto siamo interessati a ottenere la sequenza di DNA di per sé. Se così fosse, il plasmide verrebbe utilizzato per creare più copie del frammento di interesse in modo da avere abbastanza DNA bersaglio per eseguire gli esperimenti pertinenti..
La tecnologia del DNA ricombinante ha aperto un numero infinito di possibilità in biologia molecolare, biotecnologia, medicina e altre aree correlate. Le sue applicazioni più eccezionali sono le seguenti.
La prima applicazione è direttamente correlata ai laboratori di biologia molecolare. La tecnologia del DNA ricombinante consente ai ricercatori di comprendere la normale funzione dei geni e le proteine generate possono essere utilizzate in ulteriori ricerche..
Le proteine prodotte utilizzando la procedura del DNA ricombinante hanno applicazioni in medicina. Due esempi molto rilevanti nel campo sono l'insulina umana e l'ormone della crescita, che viene applicato nei pazienti che mancano di questa proteina..
Grazie al DNA ricombinante, queste proteine possono essere generate senza la necessità di estrarle da un altro essere umano, il che rappresenta ulteriori complicazioni metodologiche e rischi per la salute. Ciò ha contribuito a migliorare la qualità della vita di innumerevoli pazienti..
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