Il test della coagulasi è una tecnica di laboratorio utilizzata per rivelare la presenza dell'enzima coagulasi. Questo enzima ha la proprietà di coagulare il plasma. Loeb nel 1903 fu il primo a descrivere questo enzima.
Questo test viene eseguito su cocchi Gram positivi, catalasi positivi, permettendo di distinguere i ceppi di Staphylococcus aureus dal resto degli stafilococchi, poiché è l'unico microrganismo di rilevanza clinica che lo produce.
In questo senso, i membri della famiglia delle Staphylococaceae che risultano negativi al test sono spesso indicati come Staphylococcus coagulasi negativo..
Ci sono diversi ceppi a S. aureus che può produrre coagulasi, come Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius e S. delphini.
Tuttavia, i primi tre sono di importanza clinica a livello veterinario e potrebbero essere trovati molto raramente come agente eziologico di infezioni nell'uomo, mentre S. delphini si trova solo in ambienti marini.
Inoltre, sono facilmente differenziabili perché S. hyicus Y S. intermedius non fermentare il mannitolo e S. schleiferi spp coagulans non fermenta il maltosio, né il trealosio, mentre S. aureus fa fermentare questi carboidrati.
La presenza dell'enzima coagulasi è stata collegata alla virulenza dei ceppi. Tuttavia, questa teoria è andata in pezzi, in considerazione del fatto che si osservano altre specie virulente negative per la coagulasi in grado di produrre infezioni importanti..
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Staphylococcus aureus produce due tipi di coagulasi, uno che rimane attaccato alla parete cellulare, chiamato anche fattore di agglutinazione o fattore reattivo della coagulasi (CRF), e un extracellulare che viene rilasciato in colture liquide. Questo è il motivo per cui sono chiamati rispettivamente coagulasi legata e coagulasi libera..
L'enzima coagulasi deve il suo nome all'azione che produce. Ha la capacità di trasformare il fibrinogeno in fibrina, creando un evidente coagulo quando si trova nel plasma, cioè questo enzima simula l'attività della trombina nella cascata della coagulazione.
In effetti, una delle teorie più ampiamente accettate è che la coagulasi legata reagisce con la coagulasi libera per attivare i fattori di coagulazione. Questa attivazione genera una sostanza che agisce in modo simile alla protrombina, creando un composto con la funzione di trombina..
La differenza con la normale cascata della coagulazione è che questa reazione non richiede la presenza di calcio e non è influenzata dall'eparina.
Per eseguire il test della coagulasi è sufficiente affrontare una nuova coltura di Staphylococcus con plasma preferibilmente di coniglio e osservare così la formazione o meno del coagulo.
Esistono tecniche specifiche per rilevare contemporaneamente la coagulasi legata e la coagulasi legata e libera..
Alcuni ceppi di S. aureus danno un risultato positivo più velocemente di altri. La velocità di formazione del coagulo è direttamente proporzionale alla concentrazione di coagulasi presente..
Il test della coagulasi su vetrino rileva la coagulasi legata e il test in provetta rileva sia la coagulasi legata che quella libera.
-Diapositiva pulita
-Preferibilmente si può usare plasma di coniglio, plasma umano o di cavallo. Il plasma può essere acquistato commercialmente liofilizzato e ricostituito per l'uso, oppure può essere utilizzato fresco (fresco). Un'altra valida alternativa è l'uso del fibrinogeno.
-Soluzione salina sterile (0,85%) (SSF).
Prelievo di sangue venoso umano o animale. È possibile utilizzare uno qualsiasi dei seguenti anticoagulanti: EDTA, ossalato di calcio, eparina o citrato di sodio. Mescolare bene e centrifugare. Rimuovere asetticamente il surnatante (plasma), senza globuli rossi e metterlo in una provetta sterile.
Ricostituire come specificato sulla fiala del kit commerciale.
Usando plasma citrato, mescolare il plasma in parti uguali con una soluzione satura di cloruro di sodio. Lasciar precipitare e centrifugare.
Eliminare il surnatante, ricostituire il precipitato fino a 5 volte il suo volume con acqua distillata sterile. Aggiungere 5 unità di eparina per ogni ml di fibrinogeno. Conservare in una provetta sterile.
Una goccia di soluzione salina e una goccia di plasma vengono poste separatamente su un vetrino. Prendere con l'ansa in platino 1 o 2 colonie pure del microrganismo da testare.
Mescolare la carica batterica nella goccia di plasma e ripetere l'operazione sulla goccia SSF. Osserva immediatamente i risultati. Un risultato positivo sarà quello in cui si osserva la formazione di un agglutinato macroscopico (precipitato bianco) dopo un minuto sul lato della goccia con plasma.
La caduta di SSF funge da controllo negativo. Se si osserva agglutinazione con SSF, significa che il microrganismo si autoagglutina, il che può dare risultati falsi positivi. In questo caso, deve essere confermato con il test in provetta.
Si consiglia inoltre di montare un controllo positivo con un ceppo noto di S. aureus.
Agglutinazione entro 5-20 secondi (test fortemente positivo).
Agglutinazione variabile che si verifica tra 20 secondi e un minuto (test positivo ritardato).
Un certo grado di agglutinazione dopo un minuto (evidenza dubbia). Si consiglia di ripetere il test o di confermare con il metodo in provetta.
Nessuna agglutinazione (test negativo).
Risultato con SSF. Deve sempre dare negativo, se dà positivo automaticamente il risultato del test viene invalidato.
-Provetta sterile
-Plasma
-Bagnomaria a 37 ° C.
Pipettare 0,5 ml di plasma in una provetta 12 x 75 con una pipetta sterile. Caricare il loop di platino con 2-4 colonie pure da studiare da una coltura solida per 18-24 ore e scioglierlo nel plasma mescolare accuratamente e incubare a 37 ° C per 4 ore.
Esamina il tubo nella prima ora senza scuoterlo, inclinalo solo delicatamente. Se non si vede ancora un coagulo, è possibile osservarlo ogni 30 minuti fino al completamento delle 4 ore. Se dopo 4 ore è ancora negativo, si può lasciare fino a 24 ore ma a temperatura ambiente. Osserva e riporta il risultato.
Sulla base dell'esperienza, alcuni microbiologi raccomandano di utilizzare 500 µl di una sospensione batterica da una coltura di 18 ore in mezzo liquido per eseguire il test..
Sembra offrire risultati più rapidi e affidabili rispetto all'emulsione di colonie da terreni solidi, soprattutto se è stato utilizzato plasma umano ottenuto dalla banca del sangue..
L'uso di ceppi di brodo aiuta a diluire l'eventuale presenza di anticorpi umani anti-stafilococco nel plasma che possono inibire l'azione della coagulasi..
Se si osserva un coagulo che comprende tutto il fluido (coagulazione completa) o un coagulo senza nulla nel fluido rimanente (coagulazione parziale), deve essere considerato un test positivo..
Se non si forma alcun coagulo, cioè la sospensione rimane omogenea, il test è negativo.
Il fibrinogeno viene utilizzato come il plasma e viene utilizzato sia per i test su vetrino che per i test in provetta. Procedere come descritto per il plasma e interpretare allo stesso modo.
Viene utilizzato per differenziare i file Staphylococcus aureus di stafilococchi coagulasi negativi.
Avere nuove culture di un ceppo di S. aureus da utilizzare come controllo positivo. Un ceppo di S. epidermidis come controllo negativo.
-Un test positivo non deve essere lasciato in incubazione per 24 ore, poiché il S. aureus produce una fibrinolisina che dissolve il coagulo.
-Per un test affidabile, deve essere utilizzato plasma fresco o ricostituito di recente, così come è importante utilizzare colture batteriche fresche (da 18 a 24 h). Ciò evita falsi negativi.
-Il test deve essere eseguito insieme a un controllo negativo e uno positivo.
-Alcuni terreni solidi possono interferire con il test della coagulasi. Si sconsiglia di utilizzare colonie di agar salato al mannitolo.
-Se si utilizza plasma citrato, si consiglia di inserire 5 unità di eparina per ml di plasma per evitare falsi positivi. Questo perché alcuni microrganismi diversi da S. aureus possono abbattere il citrato e causare la coagulazione del plasma. In questo caso, si consiglia di fare un test di Gram e catalasi..
-È importante, nel test in provetta, monitorare la reazione ogni 30 minuti, in quanto vi sono ceppi di S. aureus Producono alte concentrazioni di fibrinolisina e diluiranno rapidamente il coagulo appena formato. Evita i falsi negativi.
-Durante il monitoraggio del test, evitare di scuotere bruscamente la provetta, questo può distruggere l'inizio della formazione di coaguli che non verrà ripristinata in seguito, causando falsi negativi.
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