Il DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) È un colorante che, grazie alla sua proprietà fluorescente, funge da marker, essendo ampiamente utilizzato nella microscopia a fluorescenza o nella tecnica della citometria a flusso, tra gli altri. La fluorescenza che emette è blu brillante, la sua eccitazione avviene tra 455-461 nm (luce UV).
Il colorante DAPI può passare attraverso la membrana cellulare delle cellule morte con grande facilità. Può anche macchiare i nuclei delle cellule viventi, ma in questo caso la concentrazione di questo deve essere più alta.
Il colorante è in grado di accedere al DNA cellulare per il quale possiede una particolare affinità, legandosi con grande avidità alle basi azotate adenina e timina. Per questo motivo è molto utile in alcune tecniche di biologia molecolare..
Questo composto appartiene al gruppo dei coloranti indolici e ha dimostrato di avere una maggiore sensibilità al DNA rispetto al bromuro di etidio e allo ioduro di propidio, specialmente sui gel di agarosio..
L'uso di questo colorante fluorescente è molto ampio, in quanto è utile per: studiare i cambiamenti nel DNA nei processi apoptotici (morte cellulare) e quindi rilevare le cellule in questo processo; per l'impronta di foto del DNA (stampa di foto del DNA); studiare la contaminazione batterica; o per visualizzare la segmentazione nucleare.
È stato utilizzato anche nello studio delle bande cromosomiche, nella rilevazione del DNA da Mycoplasmas sp, nell'interazione DNA-proteina, nella colorazione e nel conteggio delle cellule mediante immunofluorescenza e persino per colorare i grani di polline maturi.
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DAPI è l'abbreviazione del suo nome chimico (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo). La sua formula molecolare è C16HquindiciN5. Ha un peso molecolare di 350,3. Vicino alla gamma della luce UV (da 345 a 358 nm) si verifica la massima eccitazione del complesso DAPI-DNA, mentre la massima emissione di fluorescenza si verifica tra 455-461 nm..
Questo colorante è caratterizzato dall'essere una polvere gialla, ma le strutture contrassegnate con questo fluoroforo emettono una luce blu brillante..
È un composto solubile in acqua, tuttavia, per accelerarne la dissoluzione, è possibile applicare un po 'di calore. Può essere diluito con PBS ma non direttamente disciolto in esso..
Una volta preparato il colorante, va conservato al buio, cioè al riparo dalla luce, ad una temperatura da 2 a 8 ° C (frigorifero). In queste condizioni, il colorante è stabile per più di 3 settimane o mesi..
Se protetto dalla luce ma lasciato a temperatura ambiente, la sua stabilità scende a 2 o 3 settimane, ma esposto alla luce diretta il deterioramento è molto rapido. Se si vuole conservare per molto più tempo, può essere refrigerato a -20 ° C distribuito in aliquote.
Questa colorazione si basa sulla generazione di una controcolorazione nucleare nelle principali tecniche di biologia molecolare, come: citometria a flusso, microscopia a fluorescenza e colorazione di cromosomi in metafase o nuclei interfase, tra gli altri..
Questa tecnica si basa sulla grande affinità che il colorante ha per le basi azotate (adenina e timina) contenute nel materiale genetico (DNA) nel solco minore. Mentre a livello citoplasmatico lascia pochissimo sfondo.
Quando il colorante fluorescente si lega alle regioni di adenina e timina del DNA, la fluorescenza aumenta in modo significativo (20 volte di più). Il colore che emette è blu brillante. In particolare, non vi è alcuna emissione di fluorescenza quando si lega alle coppie di basi GC (guanina-citosina).
È importante notare che sebbene abbia anche un'affinità per l'RNA, ciò non causa problemi, perché il più alto grado di emissione di energia da questa molecola si verifica a un'altra lunghezza d'onda (500 nm), a differenza del DNA, che lo fa a 460 nm . Inoltre, l'aumento della fluorescenza una volta attaccata all'RNA è solo del 20%..
DAPI viene utilizzato più per colorare le cellule morte (fisse) rispetto alle cellule vive, poiché è necessaria una concentrazione molto più alta del colorante per colorare queste ultime, questo perché la membrana cellulare è molto meno permeabile a DAPI quando è viva.
La colorazione DAPI può essere utilizzata in combinazione con fluorofori rossi e verdi per un'esperienza multicolore.
Il DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) è un eccellente fluoroforo ed è quindi ampiamente utilizzato in varie tecniche e per vari scopi. Di seguito viene spiegato l'utilizzo di DAPI nelle principali tecniche.
I ricercatori Gohde, Schumann e Zante nel 1978 furono i primi ad utilizzare e proporre DAPI come fluoroforo nella tecnica della citometria a flusso, riscuotendo un grande successo per la sua elevata sensibilità al DNA e la sua elevata intensità di emissione di fluorescenza..
L'utilizzo di DAPI in questa tecnica permette lo studio del ciclo cellulare, la quantificazione delle cellule e la colorazione delle cellule vive e morte..
Sebbene esistano altri coloranti, come il bromuro di etidio, l'ossido di Hoechst, l'arancio di acridina e lo ioduro di propidio, DAPI è uno dei più utilizzati perché è più fotostabile di quelli precedentemente citati..
Per questa tecnica è necessario fissare le cellule, per questo è possibile utilizzare etanolo assoluto o paraformaldeide al 4%. Il campione viene centrifugato e il surnatante viene scartato, successivamente le cellule vengono idratate aggiungendo 5 ml di tampone PBS per 15 minuti..
Mentre il tempo trascorre preparare il colorante DAPI con un tampone di colorazione (FOXP3 da BioLegend) a una concentrazione di 3 µM.
Centrifugare il campione, scartare il surnatante e quindi coprire con 1 ml di soluzione DAPI per 15 minuti a temperatura ambiente..
Portare il campione al citometro a flusso con il laser appropriato.
Un'altra tecnica in cui viene utilizzato DAPI è nella micro-fluorometria a flusso insieme ad un altro fluoroforo chiamato mithramycin. Entrambi sono utili per quantificare individualmente il DNA del cloroplasto, ma DAPI è più adatto per misurare le particelle del batteriofago T4..
Questa tecnica utilizza fondamentalmente sonde di DNA etichettate con un colorante fluorescente che può essere DAPI..
Il campione richiede un trattamento termico per denaturare il DNA a doppio filamento e convertirlo in due filamenti a filamento singolo. Successivamente, viene ibridato con una sonda di DNA denaturato etichettata con DAPI che ha una sequenza di interesse..
Successivamente viene lavato per eliminare ciò che non ha ibridato, viene utilizzato un contrasto per visualizzare il DNA. Il microscopio a fluorescenza permette l'osservazione della sonda ibridata.
Questa tecnica ha lo scopo di rilevare sequenze specifiche nel DNA cromosomico, potendo fare la diagnosi di alcune malattie.
Queste tecniche citomolecolari sono state di grande aiuto nella determinazione dei dettagli nello studio dei cariotipi. Ad esempio, ha mostrato le regioni ricche di coppie di basi di adenosina e timina chiamate regioni eterocromatiche o bande DAPI..
Questa tecnica è ampiamente utilizzata per lo studio dei cromosomi e della cromatina in piante e animali, nonché nella diagnosi di patologie prenatali ed ematologiche nell'uomo..
In questa tecnica, la concentrazione di DAPI consigliata è di 150 ng / ml per un tempo di 15 minuti..
I vetrini assemblati devono essere conservati al riparo dalla luce a 2-8 ° C.
Le cellule vengono fissate con paraformaldeide al 4%. Se devono essere utilizzati altri coloranti, DAPI viene lasciato alla fine come controcolorante e le cellule vengono coperte con una soluzione PBS per 15 minuti. Con il passare del tempo, preparare la soluzione DAPI diluendo con PBS, in modo che la concentrazione finale sia 300 µM.
Quindi il PBS in eccesso viene rimosso e coperto con DAPI per 5 minuti. Viene lavato più volte. Il vetrino viene osservato in un microscopio a fluorescenza sotto il filtro appropriato.
Questo composto deve essere maneggiato con cura, perché è un composto che ha proprietà mutagene. Il carbone attivo viene utilizzato per eliminare questo composto dalle soluzioni acquose che verranno scartate..
Guanti, camice e occhiali di sicurezza devono essere usati per evitare incidenti con questo reagente. In caso di contatto con la pelle o le mucose, lavare l'area con sufficiente acqua.
Non pipettare mai questo reagente con la bocca, usare pipette.
Non contaminare il reagente con agenti microbici poiché ciò porterà a risultati errati.
Non diluire il colorante DAPI più di quanto raccomandato, poiché ciò ridurrà in modo significativo la qualità della colorazione..
Non esporre il reagente alla luce diretta o tenerlo caldo poiché ciò riduce la fluorescenza.
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