Il cromatografia liquida ad alta prestazione Si tratta di una tecnica strumentale utilizzata nelle analisi chimiche con la quale è possibile separare miscele, purificarne e quantificarne i componenti, nonché effettuare altri studi. È noto con l'abbreviazione HPLC, derivata dall'inglese: Cromatografia liquida ad alta prestazione.
Quindi, come indica il nome, funziona manipolando i liquidi. Sono costituiti da una miscela composta dall'analita o dal campione di interesse e da uno o più solventi che agiscono da fase mobile; cioè quello che trascina l'analita attraverso tutte le apparecchiature HPLC e la colonna.
L'HPLC è ampiamente utilizzato dai laboratori di analisi della qualità in molte aziende; come prodotti farmaceutici e alimenti. L'analista in questione deve preparare il campione, la fase mobile, controllare la temperatura e altri parametri e posizionare le fiale all'interno della ruota o del carosello affinché l'apparecchiatura esegua le iniezioni automaticamente..
L'apparecchiatura HPLC è accoppiata ad un computer attraverso il quale è possibile osservare i cromatogrammi generati, nonché per avviare le analisi, controllare il flusso della fase mobile, programmare il tipo di eluizione (isocratica o gradiente) e accendere i rivelatori ( UV-Vis o spettrofotometro di massa).
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A differenza della cromatografia liquida convenzionale, come la cromatografia su colonna riempita con carta o gel di silice, l'HPLC non dipende dalla gravità perché il liquido bagni la fase stazionaria. Funziona invece con pompe ad alta pressione, che irrigano la fase mobile o eluente attraverso la colonna con maggiore intensità..
In questo modo non è necessario versare ogni tanto la fase mobile attraverso la colonna, ma il sistema lo fa in modo continuo e con portate maggiori..
Ma l'efficienza di questa tecnica non è dovuta esclusivamente a questo dettaglio, ma anche alle minuscole particelle di riempitivo che compongono la fase stazionaria. Essendo più piccolo, la sua area di contatto con la fase mobile è maggiore, quindi interagirà in misura migliore con l'analita e le sue molecole si separeranno di più..
Queste due caratteristiche, oltre al fatto che la tecnica consente l'accoppiamento di rivelatori, rendono l'HPLC di gran lunga superiore alla cromatografia su strato sottile o su carta. Le separazioni sono più efficienti, la fase mobile viaggia meglio attraverso la fase stazionaria e i cromatogrammi possono rilevare qualsiasi errore nell'analisi.
Sopra è un diagramma semplificato di come funziona l'apparecchiatura HPLC. I solventi si trovano nei rispettivi contenitori, predisposti con tubi flessibili in modo che la pompa ne prenda un piccolo volume nell'apparecchiatura; quindi abbiamo la fase mobile.
La fase mobile o eluente deve essere prima degasata, in modo che le bolle non influenzino la separazione delle molecole di analita, che viene miscelata con la fase mobile una volta che l'apparecchiatura ha effettuato le iniezioni..
La colonna cromatografica è situata all'interno di un forno che permette di regolare la temperatura. Pertanto, per diversi campioni ci sono temperature adeguate per ottenere separazioni ad alte prestazioni, nonché un ampio catalogo di colonne e tipi di riempimenti o fasi stazionarie per analisi in specifiche.
La fase mobile con l'analita disciolto entra nella colonna, e da essa le molecole che "sentono" meno affinità per la fase stazionaria eluiscono per prime, mentre quelle che sono più trattenute da essa eluiscono successivamente. Ogni molecola eluita genera un segnale visualizzato sul cromatogramma, dove si osservano i tempi di ritenzione delle molecole separate..
E d'altra parte, la fase mobile dopo essere passata attraverso il rivelatore finisce in un contenitore per rifiuti..
Esistono molti tipi di HPLC, ma tra tutti i più importanti sono i seguenti quattro.
La cromatografia in fase normale si riferisce a quella in cui la fase stazionaria è di natura polare, mentre la fase mobile è non polare. Sebbene sia chiamato normale, in realtà è il meno utilizzato, con la fase inversa che è la più diffusa ed efficiente..
Essendo una fase inversa, ora la fase stazionaria è apolare e la fase mobile polare. Ciò è particolarmente utile nell'analisi biochimica, poiché molte biomolecole si dissolvono meglio in acqua e solventi polari..
In questo tipo di cromatografia, l'analita, con una carica positiva o negativa, si muove attraverso la colonna, sostituendo gli ioni che ospita. Maggiore è la carica, maggiore è la sua ritenzione, motivo per cui è ampiamente utilizzato per separare i complessi ionici dei metalli di transizione..
Questa cromatografia, piuttosto che separare, ha il compito di purificare la miscela risultante. Come suggerisce il nome, l'analita viene separato non più a seconda di quanto sia strettamente correlato alla fase stazionaria, ma in base alle sue dimensioni e alle masse molecolari..
Le molecole più piccole saranno più trattenute rispetto alle molecole grandi, poiché queste ultime non sono intrappolate tra i pori dei riempitivi della colonna polimerica.
L'HPLC consente analisi sia qualitative che quantitative. A livello qualitativo, confrontando i tempi di ritenzione del cromatogramma in determinate condizioni, è possibile rilevare la presenza di un particolare composto. Tale presenza può essere indicativa di malattia, adulterazione o uso di droghe..
Pertanto, è una parte informatica dei laboratori diagnostici. Allo stesso modo si trova all'interno delle industrie farmaceutiche, in quanto consente di controllare la purezza del prodotto, nonché la sua qualità rispetto alla sua dissoluzione nell'ambiente gastrico. I materiali di partenza vengono anche sottoposti a HPLC per purificarli e garantire migliori prestazioni nella sintesi dei farmaci..
L'HPLC consente l'analisi e la separazione di miscele complesse di proteine, amminoacidi, carboidrati, lipidi, porfirine, terpenoidi ed è essenzialmente un'opzione eccellente per lavorare con estratti vegetali.
Infine, la cromatografia ad esclusione molecolare consente di selezionare polimeri di dimensioni diverse, poiché alcuni possono essere più piccoli o più grandi di altri. In questo modo si ottengono prodotti con masse molecolari medie basse o alte, fattore determinante per le loro proprietà e future applicazioni o sintesi..
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