Il TSI agar o Triple Sugar Iron Agar è un terreno di coltura solido che funge da test biochimico per guidare l'identificazione iniziale dei bacilli Gram negativi. Si basa sulla visualizzazione della fermentazione degli zuccheri presenti e della produzione di idrogeno solforato e gas.
La sua composizione e base è molto simile al test del ferro di Kligler, con la differenza che quest'ultimo contiene solo glucosio e lattosio. D'altra parte, -come suggerisce il nome- triple sugar iron agar contiene tre carboidrati fermentabili: glucosio, lattosio e saccarosio..
Inoltre, il terreno TSI ha quattro derivati proteici che lo rendono un agar molto nutriente: estratto di lievito, estratto di carne, peptone e peptone proteico. Contiene anche solfato di ammonio ferroso, tiosolfato di sodio, cloruro di sodio, rosso fenolo e agar.
L'incapacità di un microrganismo di fermentare il glucosio presente nel terreno lo esclude immediatamente dall'appartenenza alla Famiglia delle Enterobacteriaceae. Quindi, questo test è essenziale per decidere quale percorso di identificazione prendere per determinare il genere e la specie..
Ogni laboratorio decide se lavorare con l'agar TSI o con il ferro agar Kligler..
Indice articolo
Ciascuno dei composti svolge una funzione all'interno del mezzo.
Il cloruro di sodio è necessario per mantenere l'equilibrio osmotico del terreno. Mentre l'agar gli conferisce la consistenza solida.
Il pH del mezzo preparato è bilanciato a 7,3 e l'indicatore di pH (rosso fenolo) diventa giallo al di sotto di 6,8. Ciò significa che piccole quantità di acidi prodotti dalla fermentazione degli zuccheri trasformeranno il mezzo da rosso-arancio a giallo..
Se non avviene la fermentazione si avrà alcalinizzazione del mezzo mediante l'uso di peptoni, passando dal rosso-arancio al rosso intenso.
Quando i batteri metabolizzano le proteine presenti nell'agar TSI, vengono prodotte ammine che alcalinizzano il terreno (principalmente a livello di smusso), poiché la reazione richiede ossigeno. Le ammine trasformano la lunetta in rosso brillante.
Ma questo dipenderà dalla capacità dei batteri di fermentare o meno i carboidrati..
Lo studio della fermentazione degli zuccheri può dare diverse immagini e ognuna viene interpretata in modo diverso. L'interpretazione del test divide i microrganismi in 3 categorie: non fermentanti del glucosio, non fermentanti del lattosio e fermentatori del lattosio / saccarosio..
Va notato che la quantità di glucosio nel mezzo è limitata, mentre la concentrazione di lattosio e saccarosio è 10 volte superiore..
I batteri della famiglia delle Enterobacteriaceae e altri microrganismi che fermentano il glucosio inizieranno a fermentare questo zucchero poiché è il carboidrato più semplice per l'energia..
D'altra parte, il lattosio e il saccarosio sono carboidrati complessi che devono essere scomposti e convertiti in glucosio affinché possano entrare nel ciclo Embden-Meyerhof..
Quando il microrganismo inoculato non è in grado di fermentare il glucosio, molto meno sarà in grado di fermentare altri carboidrati. Pertanto, qui non si formano acidi, ma c'è formazione di ammine nello smusso a causa dell'uso di peptoni.
In questo caso, la lunetta diventa di un rosso più intenso e il fondo del tubo può rimanere invariato o può anche essere alcalinizzato, lasciando tutto il tubo rosso..
Interpretazione: K / K significa smusso alcalino / fondo alcalino o neutro
Nell'immagine all'inizio dell'articolo vedere l'immagine del tubo D..
Questo risultato indica che il microrganismo non appartiene alla famiglia delle Enterobacteriaceae..
Se i batteri sono in grado di fermentare il glucosio ma non il lattosio o il saccarosio, si verificherà quanto segue:
I batteri consumeranno tutto il glucosio presente dopo circa 6-8 ore, potendo acidificare sia il bisello che il blocco; cioè, l'agar sarà diventato completamente giallo. Ma quando il glucosio è esaurito e l'incapacità di utilizzare lattosio e saccarosio, i batteri inizieranno il metabolismo delle proteine.
Questa reazione necessita di ossigeno, quindi la degradazione dei peptoni avviene sulla superficie (bisello). Le ammine prodotte alcalinizzano la lunetta passando dal giallo al rosso. Questa reazione è evidenziata dopo 18-24 ore di incubazione..
Interpretazione: K / A significa bisello alcalino e borra acida.
Nell'immagine all'inizio dell'articolo vedere l'immagine del tubo B.
I microrganismi in grado di fermentare lattosio e saccarosio possono ovviamente fermentare il glucosio. Dopo che la quantità minima di glucosio presente nel mezzo è esaurita, il piruvato formato inizia a metabolizzare per formare acidi attraverso il ciclo aerobico di Krebs, e nel periodo da 8 a 12 ore tutto il mezzo sarà giallo.
Se i batteri sono in grado di abbattere il lattosio o il saccarosio, gli acidi continueranno a essere prodotti e dopo 18-24 ore l'intero tubo - smusso e tappo - continuerà a ingiallire.
Va notato che l'uso del glucosio viene effettuato in due modi: uno aerobico sulla smussatura del tubo e l'altro anaerobico sul fondo del tubo..
Interpretazione: A / A significa smusso acido / fondo acido. Può o non può presentare gas.
Nell'immagine all'inizio dell'articolo vedere l'immagine del tubo A.
Alcuni microrganismi sono in grado di produrre gas durante la fermentazione degli zuccheri. Il gas è evidenziato nella provetta dalla pressione che esercita all'interno dell'agar. La pressione provoca la formazione di bolle o lo spostamento dell'agar. A volte la formazione di gas può rompere il mezzo.
È importante che durante la semina del terreno TSI, la puntura venga eseguita in modo pulito attraverso il centro dell'agar fino a raggiungere il fondo. Se la puntura viene deviata verso le pareti del tubo, può causare falsi positivi nella produzione del gas, poiché sfuggirà attraverso il canale mal formato.
La produzione di gas, così come le reazioni che avvengono nella smussatura dell'agar, necessitano di ossigeno, quindi si consiglia di coprire la provetta con un tampone di cotone e, se si utilizza un tappo in bachelite, non dovrebbe essere completamente a tenuta..
La produzione di gas è segnalata come positiva (+) o negativa (-).
I batteri in grado di produrre acido solfidrico (gas incolore) assorbono lo zolfo dal tiosolfato di sodio presente nel mezzo. Una volta che l'HDueS reagisce con il solfato di ammonio ferroso, producendo solfuro di ferro (precipitato nero chiaramente visibile).
La produzione di HDueS è segnalato come positivo (+) o negativo (-).
Nell'immagine all'inizio dell'articolo vedere l'immagine del tubo C.
Pesare 62,5 g del terreno TSI (Triple Sugar Iron Agar) disidratato e scioglierlo in un litro di acqua distillata..
Riscaldare fino a quando l'agar è completamente sciolto. Bollire per un minuto, mescolando spesso. Distribuire 4 ml di terreno in 13/100 provette con tappi di cotone.
Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti. Togliete dall'autoclave e lasciate riposare ad angolo. Bisogna fare attenzione che sia la base che la lunetta abbiano la stessa distanza.
Conservare in frigorifero 2-8 ° C. Lasciar scaldare prima di seminare il ceppo batterico.
Il colore del terreno disidratato è beige chiaro e il terreno preparato è rosso-arancio.
Il pH finale del mezzo preparato è 7,3 ± 0,2.
Il test TSI è ampiamente utilizzato a livello di laboratorio di microbiologia. Questo test è essenziale per guidare il tipo di test che deve essere applicato per raggiungere l'identificazione del genere e della specie. La sua buona esecuzione e interpretazione può far risparmiare materiale e manodopera.
Se il risultato è un TSI K / K e il test della citocromo ossidasi è positivo, è noto che i test dovrebbero essere utilizzati per l'identificazione di bastoncini Gram negativi non fermentanti, come Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, tra gli altri generi. Se è ossidasi negativo, è orientato verso i generi Acinetobacter, Stenotrophomonas, ecc..
Se invece si ottiene una TSI A / A o K / A e il test della citocromo ossidasi è negativo, più i nitrati si riducono a nitriti, saremo certi che si tratta di un microrganismo appartenente alla Famiglia delle Enterobacteriaceae. In questo caso, il percorso di identificazione si concentrerà su test specifici per questo gruppo di batteri..
Se invece si ottiene un'immagine K / A o A / A e il test della citocromo ossidasi è positivo, i test aggiuntivi da assemblare saranno finalizzati all'identificazione di ceppi fermentanti che non appartengono alla Famiglia delle Enterobacteriaceae, quali come: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio e Pasteurella.
Una TSI con idrogeno solforato, ossidasi negativa, guiderà l'identificazione dei seguenti generi della famiglia Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella o Salmonella.
Una STI con poco o moderato idrogeno solforato nello smusso alcalino con un fondo alcalino e un'ossidasi positiva, guiderà l'uso dei test per l'identificazione di bacilli Gram negativi non fermentanti che producono HDueSì, proprio come Shewanella putrefaciens.
Infine, la STI può essere utilizzata per lo studio della produzione di idrogeno solforato nei bacilli Gram positivi, soprattutto quando si sospetta di Erysipelothrix rhusiopathiae.
Il terreno TSI deve essere inoculato con colonie pure, isolate in colture primarie o selettive. Se la colonia viene prelevata da terreni selettivi seminati con campioni con flora mista, è necessario prestare attenzione a prelevare solo dalla superficie, poiché nella parte inferiore della colonia possono esistere ceppi vitali inibiti in quel terreno..
Pertanto, il loop non deve mai essere raffreddato su un terreno selettivo per prendere successivamente la colonia e inoculare un terreno TSI..
La semina verrà eseguita con un cappio o un ago dritto. Verrà praticata una foratura, facendo attenzione che sia attraverso il centro del centro fino a raggiungere il fondo, quindi la semina verrà terminata inoculando la superficie a zig zag. Non fare due forature.
Incubare a 37 ° C in aerobiosi per 18-24 ore. Interpretare in questo momento, né prima né dopo.
Il test TSI deve essere letto entro 18-24 ore dall'incubazione. Una lettura prima di questo tempo può dare un falso positivo per la fermentazione A / A. Una lettura dopo questo tempo, invece, può dar luogo ad un'immagine falsa negativa di un non fermentante, a causa del consumo di peptoni che alcalinizzano il mezzo..
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