Il Agar Thayer Martin è un terreno solido altamente nutriente e selettivo per l'isolamento di Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae; entrambi noti come Neisserie patogene o clinicamente importanti.
Una delle caratteristiche speciali più importanti dell'agar Thayer Martin è il suo alto contenuto di integratori alimentari. Questa proprietà è essenziale, perché le Neisserie sono microrganismi molto esigenti dal punto di vista nutrizionale e quindi non crescono nei terreni comuni..
D'altra parte, poiché questi microrganismi si trovano normalmente in aree non sterili, è necessario aggiungere inibitori che impediscano la crescita della flora di accompagnamento, senza intaccare lo sviluppo del genere Neisseria.
Questo agar è composto da agar GC base, emoglobina, integratori alimentari aggiuntivi e un complesso di sostanze inibitorie (antibiotici e antimicotici). Le case commerciali vendono ciascuno dei supplementi separatamente.
Il campione da seminare in questo terreno dipenderà dal microrganismo che si sta cercando. In modo da Neisseria gonorrhoeae i campioni ideali sono le secrezioni vaginali e uretrali. Mentre per Neisseria meningitidis i campioni più utilizzati sono CSF, essudati faringei e rinofaringei.
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Le neisserie sono microrganismi classificati come fastidiosi e quindi il loro isolamento è difficile. Per questo motivo, Thayer Martín è un mezzo complesso e ciascuno dei suoi componenti svolge una funzione che viene spiegata di seguito:
L'agar GC contiene peptone proteico, amido di mais, cloruro di sodio, fosfato dipotassico, fosfato monopotassico e agar-agar. I suoi componenti forniscono i nutrienti di base per lo sviluppo microbico, neutralizzano gli acidi grassi tossici, aiutano a mantenere l'equilibrio osmotico, definiscono il pH e forniscono una solida consistenza al terreno..
L'emoglobina fornisce i fattori V e X (nicotinamide adenina dinucleotide NAD ed emina rispettivamente). Per questo motivo, anche le specie Haemophilus crescono in questo terreno. L'emoglobina può essere ottenuta commercialmente in una forma disidratata oppure si può aggiungere sangue bovino defibrinato fresco al terreno..
D'altra parte, al terreno Thayer-Martin deve essere aggiunto anche un integratore di arricchimento, poiché i nutrienti contenuti nell'agar base non sono sufficienti per il fabbisogno del genere Neisseria..
L'integratore di arricchimento più comunemente usato si chiama isovitalex. Contiene glutammina, adenina, NAD, cocarbossilasi, guanina, nitrato ferrico, acido p-ammino benzoico, vitamina B12, tiamina e glucosio. Tutti questi composti sono necessari per il corretto sviluppo delle Neisserie patogene.
Trattandosi di un terreno altamente nutritivo, è necessario utilizzare inibitori che impediscano la crescita di microrganismi della flora abituale della zona e favoriscano così l'isolamento del genere Neisseria..
Il complesso inibitore è composto da vancomicina, colistina e nistatina. La vancomicina inibisce la crescita di batteri Gram positivi, la colistina previene la crescita di batteri Gram negativi come Pseudomonas e alcune neisserie saprofite e la nistatina agisce sui lieviti come candida albicans.
Tuttavia, Thayer Martin Agar è stato successivamente modificato; le modifiche consistevano nell'aggiunta di trimetoprim, nell'aumento della quantità di agar e nell'aggiunta di glucosio extra. Questi cambiamenti hanno migliorato significativamente il recupero delle specie di Neisseria gonorrhoeae.
Va notato che il trimetoprim inibisce la crescita del genere Proteus e la sua conseguente formazione brulicante. In questo senso, gli antibiotici sono quelli che forniscono il carattere selettivo al terreno Thayer Martin.
Pesare 8,2 g di terreno GC disidratato e sospendere in 100 ml. Mescolare e far bollire per 1 minuto mescolando spesso per sciogliere completamente. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 minuti.
Sospendere 2 g di emoglobina disidratata in 2 o 3 ml di acqua distillata calda fino a formare una miscela uniforme. Aggiungere poco a poco altra acqua per ottenere un volume di 100 ml. La sospensione deve essere omogenea prima della sterilizzazione.
Sterilizzare in autoclave per 15 minuti.
Ricostituire la fiala commerciale con il diluente fornito dalla stessa società commerciale. Mescolare bene. La quantità di diluente da utilizzare sarà specificata nelle istruzioni del kit..
Ricostituire la fiala con il diluente fornito dalla società commerciale. Mescolare bene. La quantità di diluente da utilizzare sarà specificata nelle istruzioni del kit..
Per ogni 100 ml di GC agar procedere come segue:
Quando l'agar GC esce dall'autoclave, lasciarlo raffreddare fino a una temperatura di circa 50 ° C e aggiungere 2 ml della soluzione di emoglobina preparata, 2 ml del supplemento di arricchimento (isobitalex o britalex) e 2 ml del supplemento di inibizione. Mescolare e servire in piastre Petri sterili..
Lasciar solidificare e conservare in frigorifero fino al momento dell'uso.
Il colore del terreno preparato è rosso ciliegia. Il pH finale del mezzo è 7,2 ± 0,2
Pesare 8,2 g di terreno GC disidratato e sospendere in 100 ml. Aggiungere 1 g di agar-agar e aggiungere 0,3 g di glucosio. Mescolare e far bollire per 1 minuto mescolando spesso per sciogliere completamente. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 minuti.
Preparare l'emoglobina e il supplemento di arricchimento come descritto sopra.
L'integratore di inibizione utilizzato è V.C.N.T (vancomicina, colistina, nistatina, trimetoprim).
Procedere come descritto per l'agar Thayer Martin originale.
Lasciare riscaldare Thayer Martin Agar prima che i campioni vengano striati. I campioni comunemente usati sono tamponi faringei, tamponi nasali, secrezioni vaginali, uretrali e / o rettali e liquido cerebrospinale..
Utilizzare campioni freschi e preparare inoculi forti sull'agar. I campioni vengono seminati direttamente dallo scarico del materiale e quindi dall'esaurimento con striature sulla superficie.
Le piastre vengono incubate a 35-37 ° C per 24-48 ore in un barattolo microaerofilo (5% di CODue). Alla fine del tempo di incubazione, le piastre vengono esaminate per piccole colonie, di colore grigio e talvolta di aspetto mucoso..
Eseguire Gram e test biochimici di conferma su colonie sospette.
I seguenti ceppi microbici possono essere utilizzati per eseguire il controllo di qualità su Thayer Martin Agar.
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 e Neisseria meningitidis ATCC 13090; si prevede uno sviluppo soddisfacente in entrambi i ceppi.
Dovrebbero essere inclusi anche i seguenti ceppi: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 e candida albicans ATCC 10231. In tutti è prevista un'inibizione totale o parziale in questo terreno..
-Va tenuto presente che i batteri resistenti agli inibitori utilizzati possono crescere nel terreno.
-Ci sono ceppi di Neisseria gonorrhoeae che può essere sensibile alla concentrazione di vancomicina utilizzata. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare agar cioccolato integrato con isovitalex, ma senza inibitori..
-Esistono ceppi di lievito resistenti alla nistatina che possono crescere in questo terreno e interferire con l'isolamento delle neisserie patogene, in particolare i gonococchi..
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