Il Simmons Citrate Agar È un terreno solido utilizzato come test biochimico per l'identificazione di microrganismi, in particolare i bacilli Gram negativi. Il supporto originale è stato creato da Koser nel 1923.
Il terreno citrato di Koser consisteva in un brodo contenente fosfato di sodio, fosfato di ammonio, fosfato monopotassico, solfato di magnesio e citrato di sodio..
Come si può vedere, l'unica fonte di carbonio nel mezzo è il citrato e di azoto è il fosfato di ammonio, omettendo proteine e carboidrati come fonte di questi elementi, sono comunemente presenti in altri mezzi..
Pertanto, i batteri inoculati in questo terreno possono riprodursi solo se è in grado di assorbire il carbonio dal citrato. Il test era positivo se c'era torbidità nel mezzo, tuttavia aveva lo svantaggio che poteva verificarsi torbidità aspecifica.
Questo problema è stato risolto da Simmons aggiungendo blu di bromotimolo e agar alla formula originale di Koser. Sebbene il principio sia lo stesso, viene interpretato in modo diverso.
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Alcuni batteri hanno la capacità di sopravvivere in assenza di fermentazione o produzione di acido lattico, necessitando di ottenere energia attraverso l'utilizzo di altri substrati. In questo test l'unica fonte di carbonio offerta è il citrato.
I batteri in grado di sopravvivere in queste condizioni metabolizzano rapidamente il citrato in una via alternativa a quella tradizionale, utilizzando il ciclo dell'acido tricarbossilico o il ciclo di fermentazione del citrato..
Il catabolismo del citrato da parte dei batteri coinvolge un meccanismo enzimatico senza l'intervento del coenzima A. Questo enzima è noto con il nome di citricasi (citrato ossalacetato liasi) o citrato desmolasi. La reazione richiede la presenza di un catione bivalente, che in quel caso è fornito dal magnesio.
La reazione genera ossalacetato e piruvato, che poi danno luogo ad acidi organici nel mezzo di un pH alcalino formato dall'utilizzo della sorgente di azoto. Questi acidi organici sono usati come fonte di carbonio generando carbonati e bicarbonati, alcalinizzando ulteriormente l'ambiente..
Il terreno citrato di Simmons deve essere leggermente inoculato nella coda di pesce utilizzando un'ansa o un ago diritto e incubato per 24 ore a 35-37 ° C. Dopo il tempo, i risultati vengono osservati.
La semina viene eseguita solo sulla superficie dell'agar. Non forare.
Se il mezzo rimane il colore originale (verde) e non c'è crescita visibile, il test è negativo, ma se il mezzo diventa blu, indica la presenza di prodotti alcalini, che viene rilevata dall'indicatore di pH. In questo caso il test è positivo.
Questo perché se il batterio utilizza il carbonio del citrato, è anche in grado di prelevare l'azoto dal fosfato di ammonio con cui rilascia ammoniaca, alcalinizzando il mezzo..
D'altra parte, se si osserva una crescita dei batteri nel terreno, ma non c'è cambiamento di colore, anche il test deve essere considerato positivo, poiché se c'è crescita significa che i batteri sono stati in grado di utilizzare il citrato come fonte di carbonio , anche se al momento non ci sono cambiamenti nel pH (a volte potrebbe volerci del tempo).
Se c'è qualche dubbio sull'interpretazione del colore finale, può essere confrontato con una provetta di citrato non inoculata.
Pesare 24,2 g di terreno disidratato per un litro d'acqua. Mescolate e lasciate riposare per circa 5 minuti. Finisci di sciogliere il terreno riscaldando per 1 o due minuti, agitando frequentemente.
Versare 4 ml nelle provette e sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 minuti. Quando si lascia l'autoclave, inclinare con l'aiuto di un supporto in modo che l'agar si solidifichi a forma di becco di flauto con un piccolo blocco o fondo e più smusso.
Il pH finale del mezzo citrato è 6,9 (colore verde). Questo mezzo è molto sensibile ai cambiamenti di pH.
A pH 6 o inferiore, il mezzo diventa giallo. Questo colore non è stato osservato nel test con i batteri.
E a pH 7,6 o superiore, il mezzo cambia in un profondo colore blu di Prussia..
Simmons Citrate Agar viene utilizzato per l'identificazione di alcuni microrganismi, in particolare i bacilli appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae e altri bacilli non fermentanti il glucosio.
Il terreno citrato di Simmons è un test molto delicato, poiché si possono ottenere falsi positivi se vengono commessi determinati errori..
Le cure da porre sono le seguenti:
Non si deve effettuare un inoculo batterico molto denso o carico, in quanto può far sviluppare un colore giallo ramato nel luogo di impianto, senza intaccare il resto del terreno, ma può far credere che ci sia crescita. Non significa positività al test.
Allo stesso modo, un inoculo denso può generare un falso positivo, perché i composti organici preformati all'interno delle pareti cellulari dei batteri morenti possono rilasciare abbastanza carbonio e azoto per attivare l'indicatore di pH..
L'ideale quindi è seminare utilizzando l'ago al posto del manico in platino, per evitare di prelevare materiale in eccesso.
D'altra parte, quando si semina la batteria di test biochimici per l'identificazione del microrganismo in questione, è importante che il test citrato sia il primo ad essere inoculato, per evitare il carry-over di proteine o carboidrati da un altro mezzo ..
In questa circostanza è possibile ottenere un falso positivo, perché una qualsiasi di queste sostanze introdotte per errore verrà metabolizzata e provocherà una variazione del pH..
Un altro modo per evitare il trasferimento di sostanze è bruciare bene il cappio e prelevare un nuovo inoculo tra un test e l'altro..
Bisogna fare attenzione anche quando si tocca la colonia per eseguire l'inoculo, poiché dovrebbe essere evitato di trascinare parte dell'agar dalla coltura da cui provengono i batteri, per quanto sopra spiegato.
In questo senso, Matsen, Sherris e Branson consigliano di diluire l'inoculo in soluzione fisiologica prima di inoculare il test citrato per evitare il trasferimento di altre fonti di carbonio.
Va tenuto presente che l'intensità del colore prodotto quando il test è positivo può variare a seconda della casa commerciale.
Inoltre, ci sono microrganismi che risultano positivi a 24 ore, ma ci sono altri ceppi che richiedono 48 ore o più per produrre un cambiamento nel pH..
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