Il attività enzimatica è un modo per esprimere la quantità di enzima presente in un dato momento. Indica la quantità di substrato trasformata in prodotto, dall'azione catalitica dell'enzima per unità di tempo.
È influenzato dalle condizioni in cui avviene la reazione enzimatica, motivo per cui solitamente si riferisce alla temperatura alla quale viene misurata. Ma cosa sono gli enzimi? Sono catalizzatori biologici, in grado di accelerare la velocità di una reazione senza subire un cambiamento irreversibile durante il processo catalizzato.
Gli enzimi, in generale, sono proteine ad eccezione dei ribosomi, molecole di RNA con attività enzimatica.
Gli enzimi aumentano la velocità di reazione riducendo la barriera energetica (energia di attivazione); che deve essere scaduto per raggiungere lo stato di transizione e quindi si verifica la reazione.
Le molecole di substrato che raggiungono lo stato di transizione subiscono cambiamenti strutturali, che le portano a dare origine alle molecole del prodotto. In base alle funzioni che svolgono, gli enzimi sono classificati in sei grandi gruppi: ossiriduttasi, transferasi, idrolasi, liasi, isomerasi e ligasi..
Gli enzimi bromelina e papaina, ad esempio, sono enzimi proteolitici (idrolasi) presenti rispettivamente nell'ananas o nell'ananas e nella papaia o nella papaia..
È noto che sia l'ananas che la papaia facilitano il processo digestivo, poiché agendo gli enzimi proteolitici in essi contenuti aiutano a digerire le proteine di, cioè carni e cereali.
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L'unità enzimatica (UI) è la quantità di enzima che catalizza la trasformazione di 1 µmol di substrato in un minuto.
Successivamente, il Sistema Internazionale di Unità (SI) ha definito l'unità di attività enzimatica come la quantità di enzima che converte 1 mole di substrato in prodotto al secondo. Questa unità ha ricevuto il nome di katal (kat).
1 mole = 106 µmol e 1 minuto = 60 secondi.
Pertanto, 1 katal è uguale a 60106 UI. Poiché il katal è un'unità grande, vengono spesso utilizzate unità più piccole, come: il microkatal (µkat), 10-6 katal e nanokatal (πkat), 10-9 katal.
È il numero di unità di attività enzimatica diviso per i milligrammi di proteine nel campione in esame. L'attività specifica è direttamente correlata al grado di purificazione dell'enzima.
Esistono diversi metodi per determinare l'attività di un enzima. La scelta di un metodo particolare dipenderà dall'obiettivo del dosaggio enzimatico; l'applicabilità del metodo; accesso alle apparecchiature necessarie per condurre l'esperimento; il costo dell'utilizzo di un metodo particolare, ecc..
Esistono metodi spettrofotometrici, fluorometrici, chemiluminescenti, calorimetrici, radiometrici e cromatografici..
I metodi spettrofotometrici possono essere colorimetrici e letti nella regione ultravioletta (UV) della radiazione elettromagnetica..
Si basa sulla generazione di un cromoforo per azione enzimatica. L'attività enzimatica può essere seguita in modo continuo o discontinuo.
Nella forma continua, i reagenti vengono posti in una cuvetta nello spettrofotometro alla lunghezza d'onda desiderata, che corrisponde a quella alla quale il cromoforo ha il suo valore di densità ottica massima; e che, inoltre, non vi è interferenza con un'altra sostanza che può essere generata.
La reazione enzimatica viene avviata mediante l'aggiunta del campione contenente l'enzima, la cui attività deve essere determinata. Contemporaneamente viene avviato il cronometro e, di tanto in tanto, viene annotato il valore della densità ottica..
Poiché è nota l'equivalenza della densità ottica con le moli di substrato o il prodotto dell'azione enzimatica, a seconda della tecnica utilizzata, è possibile calcolare le moli del substrato consumato o le moli prodotte..
Inoltre, poiché è stato misurato il tempo trascorso della reazione enzimatica, si possono ottenere le moli consumate o prodotte al secondo. Pertanto, l'attività enzimatica è stabilita in unità katal.
Nella forma batch per la determinazione dell'attività enzimatica, le provette con i componenti di reazione, ad eccezione del campione contenente l'enzima o altro componente, vengono poste in un bagno a 37 ° C. La reazione inizia quindi con l'aggiunta del componente mancante..
Si lascia che si verifichi il tempo indicato dalla tecnica e la reazione termina con l'aggiunta di un composto che arresta la reazione. La densità ottica viene letta in quel momento, e infine procede come nel modo continuo per determinare l'attività enzimatica..
Il coenzima nicotinamityinucleotide, ad esempio, ha due forme: NADH (ridotto) e NAD+ (arrugginito). Allo stesso modo, il coenzima nicotinamityinucleotide fosfato ha due forme NADPH e NADP+, rispettivamente ridotto e ossidato.
Sia la forma ridotta che quella ossidata del coenzima vengono lette a una lunghezza di 260 nm dalla luce ultravioletta; nel frattempo, solo le forme ridotte vengono lette a una lunghezza di 340 nm dalla luce ultravioletta.
Pertanto, sia nelle reazioni di ossidazione che di riduzione in cui intervengono i coenzimi denominati, vengono letti a 340 nm.
La determinazione dell'attività enzimatica, in sostanza, è la stessa seguita nella forma continua del metodo colorimetrico; tranne che la densità ottica viene letta a 340 nm per osservare la generazione di NADH o NADPH, o per misurare il consumo di questi coenzimi.
Ciò dipenderà dal fatto che la reazione misurata sia ossidazione o riduzione. Tramite la corrispondenza tra la densità ottica e le moli di NADH e NADPH, a seconda dei casi, si può calcolare l'attività enzimatica dividendo le moli del coenzima per il tempo trascorso in secondi.
All'aumentare della concentrazione del substrato, l'attività enzimatica aumenta. Ma a una certa concentrazione del substrato, il sito attivo oi siti attivi dell'enzima sono saturi, quindi l'attività dell'enzima diventa costante..
Tuttavia, il prodotto dell'azione enzimatica può anche interagire con i siti attivi dell'enzima, producendo un'inibizione dell'attività enzimatica..
Il prodotto può agire come un inibitore competitivo; per esempio, si può menzionare l'enzima esochinasi. Questo enzima produce la fosforilazione del glucosio che origina il glucosio-6-fosfato, un composto che, una volta accumulato, inibisce l'esochinasi.
Può accadere che un gruppo di enzimi (A, B, C, D, E ed F) agisca sequenzialmente in una via metabolica. L'enzima B utilizza il prodotto dell'enzima A come substrato e così via.
La cellula, a seconda delle sue esigenze metaboliche, può attivare o inibire le sequenze di attività enzimatiche. Ad esempio, l'accumulo del prodotto dell'enzima F, può agire inibendo l'enzima A o qualsiasi altro enzima della sequenza.
Un enzima può essere costituito da diverse subunità, ciascuna con i suoi rispettivi siti attivi. Ma queste subunità non agiscono in modo indipendente, quindi l'attività di una delle subunità può attivare o inibire l'azione delle restanti..
Sebbene l'emoglobina non sia considerata un enzima, è un magnifico modello per il fenomeno dell'allosterismo. L'emoglobina è composta da quattro catene proteiche, due catene α e due catene β, ciascuna collegata a un gruppo eme..
Due fenomeni possono verificarsi tra le subunità: omoalosterismo ed eteroalosterismo.
Il legame del substrato a una delle subunità aumenta l'affinità delle altre subunità per il substrato, aumentando a sua volta l'attività enzimatica di ciascuna delle restanti subunità..
Allo stesso modo, l'inibizione dell'attività enzimatica in una delle subunità produce lo stesso effetto nelle restanti..
Nel caso dell'emoglobina, il legame dell'ossigeno a un gruppo eme di una delle catene proteiche provocherà un aumento dell'avidità per l'ossigeno nelle catene rimanenti..
Allo stesso modo, il rilascio di ossigeno da un gruppo eme provoca il rilascio di ossigeno dai restanti gruppi delle catene proteiche..
Il legame di una sostanza attivante o inibitrice, diversa dal substrato, a una delle subunità causerà un'attivazione o inibizione dell'attività enzimatica nelle altre subunità.
Nel caso dell'emoglobina, il legame al gruppo eme di H.+, CODue e 2,3-difosfoglicerato a una delle subunità, diminuisce l'affinità del gruppo eme per l'ossigeno, provocandone il rilascio. Questo rilascio di ossigeno è prodotto anche nelle altre catene dell'emoglobina.
All'aumentare della concentrazione del substrato, aumenta anche l'attività enzimatica. Ciò è dovuto all'aumentato accesso delle molecole di substrato ai siti attivi dell'enzima..
Ma, per una data concentrazione del substrato, tutti i siti attivi dell'enzima sono saturati con esso, facendo sì che l'attività enzimatica non aumenti anche se la concentrazione del substrato è aumentata..
Gli enzimi hanno un pH ottimale al quale l'affinità dell'enzima per il substrato è massima. A questo pH si raggiunge il valore massimo di attività enzimatica.
L'eccessiva acidità o basicità del mezzo può provocare una denaturazione dell'enzima, riducendone di conseguenza l'attività..
Il profilo del pH dell'attività enzimatica è vario. Così, ad esempio, la pepsina ha un'attività massima tra 1-2 unità di pH; la tripsina ha un pH ottimale di 8; e la papaina ha un'attività costante tra un intervallo di pH compreso tra 4 e 8.
L'attività enzimatica aumenta all'aumentare della temperatura. In generale, l'attività enzimatica raddoppia per ogni 10 gradi di aumento, fino a raggiungere la temperatura ottimale per l'attività enzimatica..
Tuttavia, quando la temperatura ottimale viene superata, l'attività enzimatica tende a diminuire all'aumentare della temperatura della reazione. Ciò è dovuto al fatto che le proteine, e quindi gli enzimi, subiscono denaturazione a causa di un eccessivo aumento della temperatura..
In generale, gli enzimi hanno un'attività ottimale in un intervallo di concentrazione, compreso tra 0 e 500 mmol / L. Tuttavia, per concentrazioni più elevate, l'attività enzimatica tende a diminuire.
In queste circostanze, alcune interazioni ioniche negli enzimi, necessarie per la loro massima attività, vengono bloccate..
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