Il medio OF o glucose fermentation agar è un agar semisolido appositamente progettato per lo studio del metabolismo ossidativo e fermentativo dei carboidrati in un importante gruppo di microrganismi diversi dalle Enterobacteriaceae, chiamati bacilli Gram negativi non enterici.
È stato creato da Hugh e Leifson; questi ricercatori si sono resi conto che i mezzi convenzionali per studiare la produzione di acido dai carboidrati non erano adatti a questo specifico gruppo di batteri.
Questo perché i bastoncini Gram negativi non enterici generalmente producono basse quantità di acidi, a differenza delle Enterobacteriaceae..
In questo senso, il mezzo OF ha caratteristiche speciali in grado di rilevare le piccole quantità di acido formate, sia per via ossidativa che fermentativa. Queste differenze sono legate alla quantità di peptoni, carboidrati e agar..
Questo terreno contiene meno peptoni e una maggiore concentrazione di carboidrati, riducendo così i prodotti che alcalinizzano il mezzo a causa del metabolismo proteico e aumentando la produzione di acidi dovuta all'uso di carboidrati..
D'altra parte, la diminuzione della quantità di agar favorisce la disseminazione dell'acido prodotto in tutto il terreno, oltre a permetterci di osservare la motilità.
Il terreno OF è composto da peptone, cloruro di sodio, blu di bromotimolo, fosfato dipotassico, agar e un carboidrato. Il carboidrato più comune è il glucosio, ma altri possono essere utilizzati in base a quello che si desidera studiare, come lattosio, maltosio, xilosio, tra gli altri..
Indice articolo
Come ogni terreno di coltura, il terreno OF deve contenere sostanze nutritive che garantiscano la crescita batterica; queste sostanze sono peptoni.
Il carboidrato da parte sua fornisce energia e allo stesso tempo serve a studiare il comportamento del microrganismo nei suoi confronti, cioè permette di classificare i batteri come organismi ossidativi, fermentativi o non saccarolitici..
Il mezzo OF contiene un rapporto peptone / carboidrato 1: 5 rispetto ai terreni convenzionali 2: 1. Ciò garantisce che la quantità di ammine alcaline formate dalla degradazione dei peptoni non neutralizzi la formazione di acidi deboli..
D'altra parte, il mezzo contiene cloruro di sodio e fosfato dipotassico. Questi composti stabilizzano osmoticamente il mezzo e regolano rispettivamente il pH. Il blu di bromotimolo è l'indicatore di pH, che trasforma il colore del mezzo da verde a giallo con la produzione di acido..
Alcuni microrganismi possono utilizzare i carboidrati attraverso le vie ossidative o fermentative, mentre altri non prendono nessuna delle due vie..
Ciò dipende dalle caratteristiche di ciascun microrganismo. Ad esempio, alcuni microrganismi aerobici rigidi possono ossidare alcuni carboidrati e gli anaerobi facoltativi possono ossidarsi e fermentare a seconda dell'ambiente che li circonda, mentre altri non ossidano o fermentano i carboidrati (asacarolitici).
Infine, c'è una modifica del mezzo OF raccomandato dal CDC che contiene una base OF speciale con rosso fenolo come indicatore..
Il processo di ossidazione del glucosio non richiede fosforilazione del glucosio, così come il processo di fermentazione. In questo caso il gruppo aldeidico viene ossidato a un gruppo carbossilico, dando luogo ad acido gluconico. Questo a sua volta viene ossidato a 2-chetogluconico.
Quest'ultimo si accumula o si scompone in due molecole di acido piruvico. Questo sistema richiede la presenza di ossigeno o di un composto inorganico come accettore finale di elettroni..
La produzione di acidi attraverso questa via è più debole di quella ottenuta dalla via della fermentazione.
Affinché la fermentazione del glucosio avvenga per una qualsiasi delle vie disponibili, deve prima essere fosforilata, diventando glucosio-6-fosfato.
La fermentazione del glucosio può prendere diverse strade, la principale è la via Embden-Meyerhof-Parnas, ma possono anche prendere la via Entner-Doudoroff, o la via Warburg-Dickens esoso monofosfato, nota anche come la via della degradazione dei pentosi.
La via scelta dipenderà dal sistema enzimatico che il microrganismo possiede..
Nella fermentazione del glucosio per via Embden-Meyerhof-Parnas, viene scisso in due molecole di triosio, per poi essere degradato a vari composti carboniosi, fino a raggiungere la formazione di gliceraldeide-3-fosfato. Da lì ha origine una sostanza intermedia, che è l'acido piruvico..
Da lì si formeranno vari tipi di acidi misti che possono variare da una specie all'altra..
Questo sistema si verifica in assenza di ossigeno e richiede un composto organico come accettore finale di elettroni..
Nella fermentazione del glucosio attraverso la via Entner-Doudoroff, il glucosio 6-fosfato diventa glucono-ᵼ-lattone-6-fosfato e da lì viene ossidato a 6-fosfogluconato e 2-cheto-3-deossi-6- fosfogluconato, per infine forma acido piruvico. Questo percorso ha bisogno di ossigeno perché avvenga la glicolisi.
Questo percorso è un ibrido dei precedenti 2. Inizia in modo simile alla via Entner-Doudoroff, ma successivamente si forma la gliceraldeide-3-fosfato come precursore dell'acido piruvico, come avviene nella via Embden-Meyerhof-Parnas..
Pesare:
2 g di peptone
5 g di cloruro di sodio
10 g di D-glucosio (o il carboidrato da preparare)
0,03 g di blu di bromotimolo
3 gr di agar
0,30 g di fosfato dipotassico
1 litro di acqua distillata.
Mescolare tutti i composti tranne il carboidrato e sciogliere in 1 litro di acqua distillata. Riscaldare e agitare fino a completa dissoluzione.
Quando si raffredda a 50 ° C, aggiungere 100 ml di glucosio al 10% (filtrato).
Distribuire in modo asettico 5 ml di terreno OF in provette con tappo di cotone e autoclave a 121 ° C, pressione di 15 libbre per 15 minuti.
Lasciate solidificare in posizione verticale.
Il pH del terreno dovrebbe essere 7,1 Il colore del terreno preparato è verde.
Conservare in frigorifero.
Il mezzo OF è un mezzo speciale per determinare il comportamento metabolico di un microrganismo nei confronti di un carboidrato. Soprattutto per quelli che formano acidi piccoli, deboli o nulli.
Per ogni microrganismo sono necessarie 2 provette OF, entrambe devono essere inoculate con il microrganismo da studiare. La colonia viene presa con un'impugnatura dritta e si fora al centro del tubo senza raggiungere il fondo; si possono fare diverse forature, a patto che non ci sia interesse nell'osservare la motilità.
Uno strato di vaselina liquida sterile o paraffina fusa sterile (da 1 a 2 ml circa) viene aggiunto a una delle provette ed è etichettato con la lettera "F". L'altro tubo è lasciato originale ed è etichettato con la lettera "O". Entrambe le provette vengono incubate a 35 ° C e osservate quotidianamente per un massimo di 3-4 giorni..
Tabella: Classificazione dei microrganismi in base al loro comportamento in tubi OF aperti (ossidativi) e chiusi (fermentativi)
Il gas viene osservato con la formazione di bolle o lo spostamento dell'agar.
Va notato che un organismo che ossida solo il glucosio ma non lo fermenta, non sarà in grado di fermentare nemmeno altri carboidrati, in ogni caso lo ossiderà solo. Pertanto, in questa situazione, verrà omesso il tubo sigillato per lo studio di altri carboidrati..
Inoltre, la motilità può essere vista nel mezzo OF.
Motilità positiva: crescita che non si limita alla zona di inoculo. C'è una crescita verso i lati del tubo.
Motilità negativa: crescita solo nell'inoculo iniziale.
I seguenti ceppi possono essere utilizzati come controlli di qualità: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Y Moraxella sp. I risultati attesi sono:
-Alcuni microrganismi non possono crescere nel mezzo OF. In questi casi, il test viene ripetuto ma al terreno viene aggiunto il 2% di siero o lo 0,1% di estratto di lievito..
-Le reazioni di ossidazione sono spesso osservate solo vicino alla superficie e il resto del mezzo può rimanere verde, allo stesso modo è considerato positivo.
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