Il agar cioccolato È un terreno di coltura solido, arricchito, non selettivo e non differenziale. Viene utilizzato principalmente per l'isolamento di microrganismi esigenti dal punto di vista nutrizionale, sebbene al suo interno possa crescere qualsiasi tipo di batterio..
Ecco perché la sua utilità aumenta soprattutto nella semina di campioni normalmente sterili, come CSF e liquido articolare. Anche se è compreso tra i mezzi scelti anche per la semina di campioni polimicrobici, ma in questi casi è necessaria l'aggiunta di antibiotici che inibiscono la flora concomitante..
Questo mezzo ha un caratteristico colore marrone molto simile al cioccolato, da cui il nome. La preparazione è molto simile a quella dell'agar sangue, solo in questo caso il sangue deve essere riscaldato affinché i globuli rossi si degradino..
La sua preparazione, come l'agar sangue, è molto delicata, in quanto facilmente contaminabile. Per questo molti laboratori preferiscono acquisire questo mezzo già preparato da società commerciali che ne garantiscono la qualità..
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Questo terreno è composto da una base di agar ricca di nutrienti e sangue riscaldato. L'emolisi dei globuli rossi fornisce il fattore X (emina) e il fattore V (NAD), necessari per la crescita di alcuni microrganismi, come il genere Haemophilus. È anche molto utile per isolare Neisserias sp.
Come l'agar sangue, diversi terreni possono essere utilizzati come agar base a seconda delle necessità. Tra i terreni utilizzati vi sono l'infusione cervello-cuore e la tripticasi di soia, sebbene i più consigliati siano l'agar Columbia, Müeller Hinton, GC agar e Thayer Martin agar..
Alcune varianti di agar cioccolato includono un integratore fortificato disponibile in commercio chiamato Isovitalex o Polivitex..
Questi integratori contengono vitamina B.12, L-glutammina, adenina, guanina cloridrato, acido p-amminobenzoico, nicotinamide adenina dinucleotide (NAD), pirofosfato di tiamina, nitrato ferrico, cloridrato di tiamina, cisteina cloridrato, L-cistina e glucosio.
È importante notare che l'agar cioccolato è più arricchito dell'agar sangue, ma non consente l'osservazione dei modelli di emolisi..
Questo terreno contiene digestato pancreatico di caseina e cuore, digestato peptico di carne, cloruro di sodio, agar, estratto di lievito e amido di mais. È inoltre ricco di vitamine, minerali e aminoacidi essenziali.
Questa base sanguigna riscaldata è ideale per l'isolamento dei batteri del genere Neisseria. D'altra parte, se al terreno viene aggiunto un supplemento per Brucella, il suddetto microrganismo può essere isolato. I risultati sono migliorati usando il sangue di cavallo.
Questo terreno contiene peptoni, amido di mais, tamponi monobasici e bibasici, cloruro di sodio e agar..
La maggior parte delle presentazioni di agar cioccolato preparate in commercio sono dotate di questa base e non contengono sangue riscaldato, ma invece una miscela sintetica di emina e un integratore chimico di fattori di crescita, vitamine, minerali, aminoacidi, fattore V e glucosio..
Viene utilizzato per eseguire test di sensibilità antimicrobica di microrganismi esigenti, come Streptococcus pneumoniae usando il 5% di sangue di montone riscaldato.
Viene utilizzato anche per l'isolamento primario di Neisserias e Haemophilus, ma nel caso particolare dell'isolamento di Haemophilus È preferito l'uso di sangue di cavallo, poiché è una ricca fonte di fattore X e V.
Se invece il campione da seminare proviene da una zona non sterile, si consiglia l'aggiunta di antibiotici per inibire la normale flora della zona..
Esempio per campioni respiratori in cui si sospetta la presenza di batteri del genere Haemophilus La bacitracina viene utilizzata per inibire la crescita di Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus e Neisserias saprofitiche.
Nel caso di campioni di cancro genitale, dove si sospetta Haemophilus ducreyi, È stato utilizzato con successo un agar cioccolato preparato come segue: agar Müeller-Hinton con 5% di sangue di cavallo cioccolato, 1% di arricchimento Isovitalex e 3 µg / ml di vancomicina.
Questo mezzo è speciale per l'isolamento di Neisseria gonorrhoeae. Deve contenere antibiotici per inibire la flora accompagnatoria. Viene usato sangue di agnello.
Si dovrebbero vedere le indicazioni per la preparazione dell'agar base da utilizzare. Si trovano sul retro del contenitore del mezzo disidratato. In genere descrivono quanto devi pesare per preparare un litro di terreno di coltura.
In laboratorio si può preparare la quantità esatta necessaria, che può essere più o meno di un litro.
Una regola di tre viene utilizzata per calcolare quanto pesare per preparare il volume desiderato. Esempio:
Se per 1 litro è necessario pesare 40 ge il laboratorio richiede 800 ml, si dice:
1000 ml -40 gr
800 ml - X
La formula sarà la seguente:
X = 32 gr (quantità da pesare per 800 ml).
La quantità necessaria viene pesata e posta in un pallone con l'acqua.
Scaldare a fuoco moderato e mescolare delicatamente con movimenti rotatori fino a quando il terreno disidratato si dissolve completamente, lasciando bollire per 1 minuto..
Il pallone viene posto nell'autoclave per sterilizzare il terreno a 121 ° C per 20 minuti..
Quando si lascia l'autoclave, lasciarlo riposare fino a quando la temperatura del terreno è di circa tra 56 e 70 ° C per posizionare il sangue e mescolare fino a quando il terreno diventa marrone..
Se stai aggiungendo integratori, questo è il momento di farlo. Successivamente mescolare e servire 20 ml per ciascuna capsula Petri sterile.
L'intera procedura deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare o attorno al becco Bunsen..
Lasciate riposare fino a quando non si solidifica e conservate capovolto in frigorifero.
Il mezzo di base viene preparato come descritto sopra, l'emoglobina disidratata ottenuta in commercio viene sciolta e sterilizzata in autoclave..
Entrambe le soluzioni vengono lasciate raffreddare a 50 ° C, vengono unite e viene aggiunto il supplemento. Mescolare in condizioni asettiche e poi servire in piastre Petri sterili..
È importante che il sangue sia posto alla temperatura indicata, poiché è quella ideale per lisare i globuli rossi e allo stesso tempo mantenere il fattore V, sensibile alla temperatura..
Non devono rimanere bolle sulla superficie dell'agar. Da ogni lotto di 100 piastre, una o due piastre devono essere incubate in forno a 37 ° C per 24 ore per verificarne la sterilità..
Per ottenere i migliori risultati, l'agar cioccolato dovrebbe essere usato subito dopo la preparazione..
I ceppi batterici di controllo devono essere conservati in laboratorio per valutare l'efficacia del terreno fresco per la crescita dei principali microrganismi esigenti di importanza clinica..
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