Il Agar TCBS è un terreno di coltura solido altamente selettivo e differenziale, utilizzato per l'isolamento e la coltivazione di batteri del genere Vibrio, in particolare Vibrio cholerae, V. vulnificus Y V. parahaemolyticus come i principali agenti patogeni di questo genere.
L'acronimo TCBS sta per Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Questo agar è anche noto come terreno selettivo per Vibrio. La formula originale è stata creata da Nakanishi e successivamente modificata da Kobayashi.
È composto da estratto di lievito, peptone di carne, triptein, citrato di sodio, tiosolfato di sodio, bile di bue, saccarosio, cloruro di sodio, citrato ferrico, blu di bromotimolo, blu di timolo e agar..
Questa composizione consente un adeguato sviluppo delle specie Vibrio da campioni di acqua, cibo e feci; tranne Vibrio hollisae, che non cresce in questo ambiente. Inoltre, il terreno TCBS è in grado di inibire la crescita di altri batteri associati, in particolare i coliformi..
A causa dei gravi problemi gastrointestinali ed extra-intestinali che alcune specie del genere Vibrio producono, la sua diagnosi è molto importante. Gli esseri umani vengono infettati principalmente dal consumo di cibi crudi o poco cotti dal mare o dalle acque inquinate, ma anche attraverso l'infezione delle ferite.
Per questo motivo, i laboratori clinici dovrebbero includere l'agar TCBS nello studio della coltura delle feci di campioni di feci liquide, in particolare con l'aspetto dell'acqua di riso. Soprattutto se il paziente riferisce di essere stato a contatto con l'acqua di mare o di aver consumato crostacei o pesce.
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L'estratto di lievito, i peptoni di carne e il triptein sono la fonte nutritiva di questo terreno. Tuttavia, l'agar TCBS è un terreno inospitale per la maggior parte dei batteri..
La sua elevata selettività è data dall'aggiunta di citrato di sodio e bile di bue; entrambi sono agenti inibitori che forniscono anche un pH alcalino al terreno, limitando la crescita della flora accompagnatoria e favorendo la crescita di V. cholerae, tra le altre specie. In particolare Vibrio cholerae è molto sensibile all'acidità.
Da parte sua, il cloruro di sodio bilancia osmoticamente il mezzo. Inoltre, essendo elevata la sua concentrazione, agisce anche come agente inibitorio, favorendo la crescita dei batteri alofili..
Il saccarosio è lo zucchero fermentabile che, insieme agli indicatori di pH blu bromotimolo e blu timolo, conferiscono al mezzo il suo carattere differenziale. Per questo motivo, con questo terreno è possibile differenziare i ceppi fermentanti il saccarosio da quelli non fermentanti..
Le colonie di ceppi fermentanti il saccarosio sviluppano un colore giallo e trasformeranno il terreno da verde a giallo a causa della produzione di acido. I non fermentatori diventano traslucidi e il mezzo rimane il colore originale (verde).
Allo stesso modo, questo terreno contiene tiosolfato di sodio come fonte di zolfo e citrato ferrico come agente di sviluppo. Entrambi mostrano batteri in grado di produrre acido solfidrico (gas incolore). La HDueS è formato da tiosolfato e successivamente, reagendo con citrato ferrico, si forma un precipitato nero visibile..
Infine, l'agar è quello che fornisce la consistenza solida al terreno.
Pesare 89 g del terreno disidratato e sciogliere in un litro di acqua distillata. Aiuta la dissoluzione riscaldando e mescolando frequentemente. La miscela può essere bollita per un massimo di 2 minuti..
Questo mezzo non è autoclavato. Dopo la dissoluzione va servito direttamente su piatti sterili. Quando si solidificano, vengono disposte capovolte in placche e conservate in frigorifero (2-8 ° C) fino al momento dell'uso..
Il terreno dopo la preparazione deve rimanere a pH 8,6 ± 0,2.
Il colore del terreno disidratato è beige chiaro o beige verdastro e il colore del terreno è verde bosco o verde bluastro.
È importante lasciare che le piastre si riscaldino prima di seminare i campioni..
L'esemplare più comune per l'isolamento di Vibrio sono le feci diarroiche..
Campioni di feci se non possono essere seminati immediatamente sul terreno selettivo, devono essere trasportati sul terreno Cary Blair..
Per aumentare la sensibilità della coltura, le feci possono essere fatte passare attraverso l'acqua di peptoni a pH 8,4 come mezzo di arricchimento per un massimo di 8 ore, da lì vengono sottocolturate al terreno TCBS..
Va inoltre tenuto presente che alcuni ceppi di Vibrio possono causare setticemia in pazienti immunosoppressi, pertanto possono essere isolati da emocolture. Allo stesso modo, campioni di acqua e cibo dal mare possono essere analizzati in caso di epidemie di colera..
L'inoculo del campione in esame deve essere prominente, la semina viene eseguita con il metodo della striatura per esaurimento. Le piastre vengono incubate a 37 ° C per 24 ore in aerobiosi.
Le presunte colonie di Vibrio cholerae sono di media grandezza, lisci, opachi, a bordi sottili e di colore giallo a causa della fermentazione del saccarosio.
Allo stesso modo, le specie di V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii e alcuni V. vulnificus. Altre specie di Vibrio clinicamente importanti come V. parahaemolyticus non fermentano il saccarosio, sviluppandosi come colonie verde oliva.
D'altra parte, va tenuto presente che alcuni ceppi di Aeromonas e Plesiomonas che sono ossidasi (+) possono crescere in questo terreno, sviluppando colonie gialle che possono confondere il clinico. Mentre alcuni ceppi di Pseudomonas anche ossidasi (+) crescono come colonie verdi proprio come V. parahaemolyticus.
Il test dell'ossidasi positivo per il genere Vibrio non deve mai essere eseguito da colonie ottenute da TCBS agar, poiché il risultato ottenuto sarà un falso negativo. I composti nel mezzo interferiscono fortemente con questo test. Pertanto, deve essere eseguito da sottocolture su agar sangue..
Per dimostrare che il terreno è in buone condizioni, si consiglia di seminare ceppi di controllo noti o certificati e osservare se la crescita soddisfa le caratteristiche previste..
Per questo puoi usare ceppi di:
-Vibrio cholerae - crescita soddisfacente (colonie gialle, bordo traslucido).
-Vibrio parahaemolyticus - crescita soddisfacente (colonia con centro verde e bordo traslucido).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - crescita soddisfacente (colonie gialle con aloni dello stesso colore intorno alla colonia).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - inibizione totale o parziale (piccole colonie gialle o traslucide).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853- inibizione parziale o totale (colonie blu).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Completamente inibito.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 - Inibizione totale o parziale. (Piccole colonie centro verde bordo traslucido).
L'incubazione del terreno non inoculato deve rimanere invariata.
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